Bevacizumab抑制人肝癌細胞及其移植瘤的生長

萬騁，崔斐，張苗，羅榮城*

(1.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院腎內科，江蘇南京210008；2.南方醫科大學南方醫院腫瘤中心，廣東廣州510515)

Bevacizumab抑制人肝癌細胞及其移植瘤的生長

萬騁1，崔斐2，張苗1，羅榮城2*

(1.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院腎內科，江蘇南京210008；2.南方醫科大學南方醫院腫瘤中心，廣東廣州510515)

目的探討Bevacizumab對肝癌細胞株HepG2及荷肝癌裸鼠移植瘤生長的影響。方法不同濃度Bevacizumab處理HepG2細胞48 h后，MTT法檢測Bevacizumab對細胞增殖的抑制作用，設不加藥物的HepG2細胞為對照組。建立荷肝癌細胞株HepG2裸鼠皮下移植瘤模型，隨機分為Bevacizumab組和空白對照組，觀察用藥前后腫瘤大小，計算抑瘤率；應用免疫組化計算腫瘤微血管密度。結果Bevacizumab可抑制HepG2細胞增殖；與空白對照組比較，Bevacizumab可延緩移植瘤的生長，MVD值明顯降低(P=0.000)。結論Bevacizumab可直接抑制肝癌細胞株HepG2的增殖；Bevacizumab主要通過抑制新生血管的形成而抑制移植瘤的生長。

Bevacizumab；肝細胞癌；HepG2細胞株；裸鼠

肝癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，血管內皮生長因子(VEGF)在肝癌發生、發展過程中占有十分重要的地位。Bevacizumab是針對VEGF重組人源化單克隆抗體，已經成為包括肝癌在內的多種惡性腫瘤的重要治療方法。目前實驗表明Bevacizumab主要通過抑制內皮細胞增殖，從而抑制腫瘤血管生成而發揮作用的。而Bevacizumab對腫瘤細胞本身的作用不很清楚，且國內尚無有關Bevacizumab治療肝癌的實驗動物方面的研究。故我們通過研究Bevacizumab對肝癌細胞株和其荷裸鼠移植瘤生長的影響來探討Bevacizumab在肝細胞癌治療中的應用前景。

1 材料與方法

1.1 細胞株及實驗動物人肝癌細胞株HepG2購自中國醫學科學院上海細胞生物學研究所。BALB/C裸鼠20只，5周齡左右，體重約20 g，購自南方醫科大學實驗動物中心，并于SPF條件下飼養。

1.2 主要藥物和試劑Bevacizumab(商品名：Avastin)購自美國Roche公司，MTT為美國Sigma公司產品；兔抗人CD34及PV二步法免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒為廣州華拓生物公司產品。

1.3 MTT法測定細胞增殖情況將HepG2細胞株接種于96孔培養板中，達到5×103個/孔，培養24h后換用含Bevacizumab的無血清培養基，使Bevacizumab的濃度分別為0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、20 μg/ml，每個濃度設8個復孔，繼續培養48 h后用MTT法檢測細胞增殖情況。重復該實驗3次。計算抑制率= (1-用藥組OD值/對照組OD值)×100%，并繪制效應曲線，以濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標。

1.4 建立荷HepG2細胞株的裸鼠移植瘤模型及分組用藥將單細胞懸液，選兩只裸鼠的移植瘤作為瘤源，將以對數生長期HepG2細胞制成的單細胞懸液注入其皮下，待腫瘤長至1.5 cm3時處死裸鼠，取出瘤體，分別種入裸鼠背部靠近腋窩處皮膚。接種后每隔4 d測量腫瘤的直徑，當直徑至0.5 cm左右時即可用于實驗。實驗分為兩組：A組(空白對照組)予無菌生理鹽水，0.2 ml/只；B組(Bevacizumab組)注射Bevacizumab，5 mg·kg-1·只-1。兩組均為腹腔注射，2次/周×4周。從接種后第19天起，每周測移植瘤的長徑(a)和短徑(b)，計算瘤體積(V=ab2/2)。計算抑瘤率(%)=(1-A組平均瘤體積/B組平均瘤體積)×100%。

1.5 檢測移植瘤微血管密度(MVD)根據PowerVision?二步法對移植瘤進行免疫組化染色，按Weidner微血管計數方法計數其微血管量。在100倍鏡下選取微血管密度最高的區域，然后在400倍鏡下選取3個高倍視野，計數微血管量，每個視野計數3次，取其平均值作為MVD值。

1.6 統計學處理統計軟件采用SPSS11.5，實驗結果以均數±標準差()表示。采用單因素方差分析(LSD法)分析Bevacizumab對HepG2細胞增殖的影響及兩組微血管密度(MVD)的比較。對照組與治療組間移植瘤體積比較采用重復測量數據的方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Bevacizumab抑制HepG2細胞的增殖不同濃度Bevacizumab均可抑制HepG2細胞的增殖。Bevacizumab濃度為0.1 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml組的HepG2細胞增殖抑制率分別為(8.76± 1.15)%、(26.83±1.20)%、(31.87±1.30)%、(28.20± 1.28)%，其中Bevacizumab濃度為1 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml的三組與對照組相比差異均有統計學意義(P值分別為0.001，0.000，0.001)，見圖1。

圖1 Bevacizumab抑制HepG2細胞增殖情況

2.2 Bevacizumab抑制人肝癌HepG2裸鼠移植瘤生長的情況繪制移植瘤的生長曲線，見圖2。第28天，空白對照組和Bevacizumab組的腫瘤體積分別為(1.26±0.34)cm3、(0.72±0.36)cm3。Bevacizumab組的抑瘤率為40.35%。Bevacizumab組治療后體積與對照組相比增長較緩慢，且有顯著統計學意義(P值為0.002)。因此，Bevacizumab可延緩荷人肝癌HepG2裸鼠移植瘤的生長。

2.3 Bevacizumab減少人肝癌HepG2裸鼠移植瘤的微血管密度結果顯示，空白對照組的移植瘤組織中可見豐富的新生血管生成，而經Bevacizumab治療后的移植瘤組織中新生血管形成顯著減少。Bevacizumab組的MVD減少，其與空白對照組的MVD分別為29.40 2.07，18.40 2.07，二者比較差異有統計學意義(P值均為0.000)。

圖2 Bevacizumab對荷人肝癌細胞HepG2裸鼠移植瘤生長的影響

3 討論

肝細胞癌是全世界重大的治療難題，超過70%的患者確診時已無手術治療的指征。而傳統的化療因存在耐藥性對大多數患者無效。而生物靶向藥物Bevacizumab(Avastin，rhuMAb-VEGF)已被多項Ⅱ期臨床試驗證明其對進展期的肝癌有一定的治療療效[1-2]。目前，Bevacizumab已知的治療作用主要是通過抑制腫瘤血管的生長而發揮的，但是，有關Bevacizumab是否可直接抑制腫瘤細胞增殖方面的研究很少。近年來多項研究發現腫瘤細胞表面也存在VEGF受體(VEGFR)的表達，且有自分泌作用。因此，抗VEGF治療也可能通過阻斷VEGF與腫瘤細胞表面的VEGFR結合來抑制腫瘤細胞的自分泌途徑，從而抑制其生長。Calvani等[3]最近針對Bevacizumab對結腸癌細胞是否有直接作用的研究結果顯示，VEGF/KDR/HIF-1-alpha自分泌途徑不同程度的促進了缺氧的結腸癌細胞的生存，而Bevacizumab可通過阻斷該自分泌途徑，從而抑制結腸癌細胞的增殖。而本研究前期試驗已表明[4]，肝癌細胞株也可能存在VEGF的自分泌機制，而且Bevacizumab作用于肝癌細胞株后，VEGF及其受體KDRm-RNA表達受抑。且目前該實驗顯示Bevacizumab對肝癌細胞株HepG2的直接抑制增殖作用，除其中最低濃度1 μg/ml外不同濃度的Bevacizumab組的抑制作用與對照組相比差異有統計學差異(P值分別為0.001，0.000，0.001)。綜上所述，Bevacizumab可能通過阻斷由KDR介導的VEGF自分泌途徑而發揮直接抑制肝癌細胞增殖的作用。

目前研究表明，在包括肝癌、結直腸癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中均發現VEGF呈高表達[5]，且VEGF與腫瘤的血管生成和轉移密切相關[6]，抗VEGF和抗血管生成治療也可為惡性腫瘤包括肝癌的治療展現美好的前景。Mabuchi等[7]研究表明貝伐單抗可通過抑制腫瘤血管生成而明顯抑制荷卵巢癌細胞裸鼠移植瘤的生長。微血管密度(Microvessel density，MVD)是反映腫瘤血管生成的重要指標。Finn等[8]研究表明貝伐單抗可明顯減少荷肝癌細胞移植瘤的MVD，延長老鼠的疾病進展時間。本研究中，Bevacizumab也可抑制人肝癌細胞HepG2裸鼠移植瘤的生長(P值分別為0.002)，抑瘤率為40.35%。Bevacizumab組MVD明顯減小，與對照組相比差異有統計學意義(P=0.000)，該結果證實了Bevacizumab可通過抑制腫瘤新生血管的形成而發揮作用。

綜上所述，本研究表明Bevacizumab可直接抑制肝癌細胞的增殖，也可通過抑制腫瘤新生血管的形成來抑制荷肝癌細胞裸鼠移植瘤的生長。這為Bevacizumab治療肝細胞癌提供了新的理論依據，也為抗腫瘤血管生成的靶向治療奠定了實驗基礎。

[1]Sun W,Sohal D,Haller DG,et al.Phase 2 trial of bevacizumab, capecitabine,and oxaliplatin in treatment of advanced hepatocellular carcinoma[J].Cancer,2011,117(14):3187-3192.

[2]Abby B.Siegel,Emil I.Cohen,Allyson Ocean,et al.Phase II trial evaluating the clinical and biologic effects of bevacizumab in unresectable hepatocellular carcinoma[J].Journal of Clinical Oncology, 2008,26(18):2992-2998.

[3]Calvani M,Trisciuoglio D,Bergamaschi C,et al．Differential involvement of vascular endothelial growth factor in the survival of hypoxic colon cancer cells[J].Cancer Res,2008,68(1):285-291．

[4]萬騁,崔斐,陳斌,等.抗腫瘤血管生成藥bevacizumab對VEGF促人肝癌細胞株HepG2增殖的阻斷作用[J].第二軍醫大學學報,2008,29(9):1060-1064.

[5]Poon RT,Fan ST,Wong J．Clinical implications of circulating angiogenic factors in cancer patients[J].J Clin Oncol,2001,19: 1207-1225．

[6]Yao DF,Wu XH,Zhu Y,et al．Quantitative analysis of vascular endothelial growth factor,microvascular density and their clinicopathologic features in human hepatocellular carcinoma[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2005,4:220-226.

[7]Mabuchi S,Kawase C,Altomare DA,et al.Vascular endothelial growth factor is a promising therapeutic target for the treatment of clear cell carcinoma of the Ovary[J].molecular cancer therapeutics,2010,9(8):2411-2422.

[8]Finn RS,Bentley G,Britten CD,et al.Targeting vascular endothelial growth factor with the monoclonal antibody bevacizumab inhibits human hepatocellular carcinoma cells growing in an orthotopic mouse model[J].Liver International,2009,29(2):143-318.

Bevacizumab inhibit the growth of hepatocellular carcinoma cells and hepatoma carcinoma xenografts in nude mice.

WAN Cheng1,CUI Fei2,ZHANG Miao1,LUO Rong-cheng2.1.Department of Nephrology,Drum Tower HospitalAffiliated to Medical School of Nanjing University,Nanjing 210008,Jiangsu,CHINA;2.Cancer Center,Nanfang Hospital of Southern Medical University,Guangzhou,510515,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo evaluate the effect of Bevacizumab on the growth of human hepatocellular carcinoma(HCC)HepG2 cells and HCC Xenografts in nude mice.MethodsAfter treatment with different dose of Bevacizumab for 48 h,the proliferation of HepG2 cells was analyzed by MTT assay.The control group was not treated with Bevacizumab.The HepG2 HCC Xenograft models were constructed and divided into two groups:the Bevacizumab group and the control group.Tumor dimensions were recorded and the microvessel density(MVD)was measured by immunohistochemistry.ResultsBevacizumab may inhibit the proliferation of HepG2 cells directly.Compared with the control group,the transplanted tumors in the Bevacizumab group grew slower,and MVD in the bevacizumab group decreased significantly(P=0.000)．ConclusionBevacizumab could inhibit the proliferation of HepG2 cells and the growth of HCC xenograft mainly through reducing angiogenesis.

Bevacizumab;Hepatocellular carcinoma;HepG2 cell line;Nude Mice

R735.7

A

1003—6350(2012)08—018—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.08.008

2011-12-12)

萬騁(1983—)，女，江西省樂平市人，住院醫師，碩士。

*通訊作者：羅榮城，教授，主任醫師，博士生導師，E-mail：lrc@nfhoc.com