Bevacizumab抑制人肝癌細(xì)胞及其移植瘤的生長(zhǎng)

萬(wàn)騁，崔斐，張苗，羅榮城*

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇南京210008；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院腫瘤中心，廣東廣州510515)

Bevacizumab抑制人肝癌細(xì)胞及其移植瘤的生長(zhǎng)

萬(wàn)騁1，崔斐2，張苗1，羅榮城2*

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇南京210008；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院腫瘤中心，廣東廣州510515)

目的探討B(tài)evacizumab對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2及荷肝癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響。方法不同濃度Bevacizumab處理HepG2細(xì)胞48 h后，MTT法檢測(cè)Bevacizumab對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，設(shè)不加藥物的HepG2細(xì)胞為對(duì)照組。建立荷肝癌細(xì)胞株HepG2裸鼠皮下移植瘤模型，隨機(jī)分為Bevacizumab組和空白對(duì)照組，觀察用藥前后腫瘤大小，計(jì)算抑瘤率；應(yīng)用免疫組化計(jì)算腫瘤微血管密度。結(jié)果Bevacizumab可抑制HepG2細(xì)胞增殖；與空白對(duì)照組比較，Bevacizumab可延緩移植瘤的生長(zhǎng)，MVD值明顯降低(P=0.000)。結(jié)論Bevacizumab可直接抑制肝癌細(xì)胞株HepG2的增殖；Bevacizumab主要通過(guò)抑制新生血管的形成而抑制移植瘤的生長(zhǎng)。

Bevacizumab；肝細(xì)胞癌；HepG2細(xì)胞株；裸鼠

肝癌是世界上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中占有十分重要的地位。Bevacizumab是針對(duì)VEGF重組人源化單克隆抗體，已經(jīng)成為包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的重要治療方法。目前實(shí)驗(yàn)表明Bevacizumab主要通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而抑制腫瘤血管生成而發(fā)揮作用的。而B(niǎo)evacizumab對(duì)腫瘤細(xì)胞本身的作用不很清楚，且國(guó)內(nèi)尚無(wú)有關(guān)Bevacizumab治療肝癌的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方面的研究。故我們通過(guò)研究Bevacizumab對(duì)肝癌細(xì)胞株和其荷裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響來(lái)探討B(tài)evacizumab在肝細(xì)胞癌治療中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。BALB/C裸鼠20只，5周齡左右，體重約20 g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并于SPF條件下飼養(yǎng)。

1.2 主要藥物和試劑Bevacizumab(商品名：Avastin)購(gòu)自美國(guó)Roche公司，MTT為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；兔抗人CD34及PV二步法免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒為廣州華拓生物公司產(chǎn)品。

1.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況將HepG2細(xì)胞株接種于96孔培養(yǎng)板中，達(dá)到5×103個(gè)/孔，培養(yǎng)24h后換用含Bevacizumab的無(wú)血清培養(yǎng)基，使Bevacizumab的濃度分別為0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、20 μg/ml，每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。重復(fù)該實(shí)驗(yàn)3次。計(jì)算抑制率= (1-用藥組OD值/對(duì)照組OD值)×100%，并繪制效應(yīng)曲線，以濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)。

1.4 建立荷HepG2細(xì)胞株的裸鼠移植瘤模型及分組用藥將單細(xì)胞懸液，選兩只裸鼠的移植瘤作為瘤源，將以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞制成的單細(xì)胞懸液注入其皮下，待腫瘤長(zhǎng)至1.5 cm3時(shí)處死裸鼠，取出瘤體，分別種入裸鼠背部靠近腋窩處皮膚。接種后每隔4 d測(cè)量腫瘤的直徑，當(dāng)直徑至0.5 cm左右時(shí)即可用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為兩組：A組(空白對(duì)照組)予無(wú)菌生理鹽水，0.2 ml/只；B組(Bevacizumab組)注射Bevacizumab，5 mg·kg-1·只-1。兩組均為腹腔注射，2次/周×4周。從接種后第19天起，每周測(cè)移植瘤的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，計(jì)算瘤體積(V=ab2/2)。計(jì)算抑瘤率(%)=(1-A組平均瘤體積/B組平均瘤體積)×100%。

1.5 檢測(cè)移植瘤微血管密度(MVD)根據(jù)PowerVision?二步法對(duì)移植瘤進(jìn)行免疫組化染色，按Weidner微血管計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)其微血管量。在100倍鏡下選取微血管密度最高的區(qū)域，然后在400倍鏡下選取3個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)微血管量，每個(gè)視野計(jì)數(shù)3次，取其平均值作為MVD值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS11.5，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。采用單因素方差分析(LSD法)分析Bevacizumab對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響及兩組微血管密度(MVD)的比較。對(duì)照組與治療組間移植瘤體積比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Bevacizumab抑制HepG2細(xì)胞的增殖不同濃度Bevacizumab均可抑制HepG2細(xì)胞的增殖。Bevacizumab濃度為0.1 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml組的HepG2細(xì)胞增殖抑制率分別為(8.76± 1.15)%、(26.83±1.20)%、(31.87±1.30)%、(28.20± 1.28)%，其中Bevacizumab濃度為1 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml的三組與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.001，0.000，0.001)，見(jiàn)圖1。

圖1 Bevacizumab抑制HepG2細(xì)胞增殖情況

2.2 Bevacizumab抑制人肝癌HepG2裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的情況繪制移植瘤的生長(zhǎng)曲線，見(jiàn)圖2。第28天，空白對(duì)照組和Bevacizumab組的腫瘤體積分別為(1.26±0.34)cm3、(0.72±0.36)cm3。Bevacizumab組的抑瘤率為40.35%。Bevacizumab組治療后體積與對(duì)照組相比增長(zhǎng)較緩慢，且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值為0.002)。因此，Bevacizumab可延緩荷人肝癌HepG2裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。

2.3 Bevacizumab減少人肝癌HepG2裸鼠移植瘤的微血管密度結(jié)果顯示，空白對(duì)照組的移植瘤組織中可見(jiàn)豐富的新生血管生成，而經(jīng)Bevacizumab治療后的移植瘤組織中新生血管形成顯著減少。Bevacizumab組的MVD減少，其與空白對(duì)照組的MVD分別為29.40 2.07，18.40 2.07，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均為0.000)。

圖2 Bevacizumab對(duì)荷人肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

3 討論

肝細(xì)胞癌是全世界重大的治療難題，超過(guò)70%的患者確診時(shí)已無(wú)手術(shù)治療的指征。而傳統(tǒng)的化療因存在耐藥性對(duì)大多數(shù)患者無(wú)效。而生物靶向藥物Bevacizumab(Avastin，rhuMAb-VEGF)已被多項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)證明其對(duì)進(jìn)展期的肝癌有一定的治療療效[1-2]。目前，Bevacizumab已知的治療作用主要是通過(guò)抑制腫瘤血管的生長(zhǎng)而發(fā)揮的，但是，有關(guān)Bevacizumab是否可直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面的研究很少。近年來(lái)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表面也存在VEGF受體(VEGFR)的表達(dá)，且有自分泌作用。因此，抗VEGF治療也可能通過(guò)阻斷VEGF與腫瘤細(xì)胞表面的VEGFR結(jié)合來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的自分泌途徑，從而抑制其生長(zhǎng)。Calvani等[3]最近針對(duì)Bevacizumab對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞是否有直接作用的研究結(jié)果顯示，VEGF/KDR/HIF-1-alpha自分泌途徑不同程度的促進(jìn)了缺氧的結(jié)腸癌細(xì)胞的生存，而B(niǎo)evacizumab可通過(guò)阻斷該自分泌途徑，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。而本研究前期試驗(yàn)已表明[4]，肝癌細(xì)胞株也可能存在VEGF的自分泌機(jī)制，而且Bevacizumab作用于肝癌細(xì)胞株后，VEGF及其受體KDRm-RNA表達(dá)受抑。且目前該實(shí)驗(yàn)顯示Bevacizumab對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2的直接抑制增殖作用，除其中最低濃度1 μg/ml外不同濃度的Bevacizumab組的抑制作用與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值分別為0.001，0.000，0.001)。綜上所述，Bevacizumab可能通過(guò)阻斷由KDR介導(dǎo)的VEGF自分泌途徑而發(fā)揮直接抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。

目前研究表明，在包括肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)VEGF呈高表達(dá)[5]，且VEGF與腫瘤的血管生成和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]，抗VEGF和抗血管生成治療也可為惡性腫瘤包括肝癌的治療展現(xiàn)美好的前景。Mabuchi等[7]研究表明貝伐單抗可通過(guò)抑制腫瘤血管生成而明顯抑制荷卵巢癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。微血管密度(Microvessel density，MVD)是反映腫瘤血管生成的重要指標(biāo)。Finn等[8]研究表明貝伐單抗可明顯減少荷肝癌細(xì)胞移植瘤的MVD，延長(zhǎng)老鼠的疾病進(jìn)展時(shí)間。本研究中，Bevacizumab也可抑制人肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)(P值分別為0.002)，抑瘤率為40.35%。Bevacizumab組MVD明顯減小，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，該結(jié)果證實(shí)了Bevacizumab可通過(guò)抑制腫瘤新生血管的形成而發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究表明Bevacizumab可直接抑制肝癌細(xì)胞的增殖，也可通過(guò)抑制腫瘤新生血管的形成來(lái)抑制荷肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。這為Bevacizumab治療肝細(xì)胞癌提供了新的理論依據(jù)，也為抗腫瘤血管生成的靶向治療奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Bevacizumab inhibit the growth of hepatocellular carcinoma cells and hepatoma carcinoma xenografts in nude mice.

WAN Cheng1,CUI Fei2,ZHANG Miao1,LUO Rong-cheng2.1.Department of Nephrology,Drum Tower HospitalAffiliated to Medical School of Nanjing University,Nanjing 210008,Jiangsu,CHINA;2.Cancer Center,Nanfang Hospital of Southern Medical University,Guangzhou,510515,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo evaluate the effect of Bevacizumab on the growth of human hepatocellular carcinoma(HCC)HepG2 cells and HCC Xenografts in nude mice.MethodsAfter treatment with different dose of Bevacizumab for 48 h,the proliferation of HepG2 cells was analyzed by MTT assay.The control group was not treated with Bevacizumab.The HepG2 HCC Xenograft models were constructed and divided into two groups:the Bevacizumab group and the control group.Tumor dimensions were recorded and the microvessel density(MVD)was measured by immunohistochemistry.ResultsBevacizumab may inhibit the proliferation of HepG2 cells directly.Compared with the control group,the transplanted tumors in the Bevacizumab group grew slower,and MVD in the bevacizumab group decreased significantly(P=0.000)．ConclusionBevacizumab could inhibit the proliferation of HepG2 cells and the growth of HCC xenograft mainly through reducing angiogenesis.

Bevacizumab;Hepatocellular carcinoma;HepG2 cell line;Nude Mice

R735.7

A

1003—6350(2012)08—018—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.08.008

2011-12-12)

萬(wàn)騁(1983—)，女，江西省樂(lè)平市人，住院醫(yī)師，碩士。

*通訊作者：羅榮城，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，E-mail：lrc@nfhoc.com