阿魏酸鈉對神經病理性疼痛大鼠脊髓Bcl-2和Bax的影響

解小麗，周青山，程周

(1.中山市人民醫院麻醉科，廣東中山528403；2.武漢大學人民醫院麻醉科，湖北武漢430060)

阿魏酸鈉對神經病理性疼痛大鼠脊髓Bcl-2和Bax的影響

解小麗1，周青山2，程周1

(1.中山市人民醫院麻醉科，廣東中山528403；2.武漢大學人民醫院麻醉科，湖北武漢430060)

目的觀察阿魏酸鈉對神經病理性疼痛大鼠脊髓中Bcl-2和Bax表達的影響，探討阿魏酸鈉對脊髓的保護作用。方法成年雄性Wistar大鼠隨機分為兩組：A組(n=30)為生理鹽水組，結扎左側坐骨神經后每天腹腔注入2ml生理鹽水；B組(n=30)為阿魏酸鈉組，結扎坐骨神經后向腹腔注入2ml阿魏酸鈉，100mg·kg-1· d-1，連續7 d。分別在術前及術后6 h、1 d、3 d、7 d進行行為學測定，記錄縮足閾值，檢測脊髓中Bcl-2和Bax的表達，采用TUNEL法觀察脊髓神經元凋亡。結果兩組大鼠坐骨神經結扎后均可誘發出神經病理性疼痛；凋亡神經元和Bcl-2和Bax陽性細胞均于術后6 h開始出現，并于術后1 d開始迅速增加，術后3 d達峰值。與生理鹽水組相比較，阿魏酸鈉組大鼠脊髓組織中神經細胞凋亡指數和Bax表達水平顯著降低，而Bcl-2的表達水平卻顯著增加(P＜0.05)。結論阿魏酸鈉可能通過促進Bcl-2表達，抑制Bax表達，從而抑制了大鼠脊髓神經元凋亡，對脊髓有保護作用。

阿魏酸鈉；脊髓保護；Bcl-2；Bax

阿魏酸鈉是阿魏酸的鈉鹽，有增強免疫、清除自由基、抗氧化，抗炎、解痙鎮痛等作用，能夠抑制細胞毒性物質的表達，還能改善受損內皮細胞功能，改善炎癥及血管生成，已在神經變性、心血管、糖尿病及腫瘤疾病方面得到應用，臨床上經常應用于治療周圍神經病變[1-2]。在本研究中，我們給神經病理性疼痛大鼠腹腔注射阿魏酸鈉，觀察其對大鼠脊髓中Bcl-2和Bax表達的影響，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗材料及分組阿魏酸鈉購于上海試劑一廠，Bcl-2和Bax購自武漢博士德生物工程有限公司，TUNEL試劑盒購于Roche公司，SP試劑盒購于北京中山生物技術有限公司，Von Frey纖維購自美國Stoelting公司。由武漢大學醫學院實驗動物中心提供健康成年雄性Wistar大鼠60只，隨機分為兩組：A組(n=30)為生理鹽水組，結扎左側坐骨神經后每天腹腔注入2 ml生理鹽水，連續7 d；B組(n=30)為阿魏酸鈉組，結扎左側坐骨神經后向腹腔注入阿魏酸鈉100 mg·kg-1·d-1(用2ml生理鹽水稀釋)，連續7 d。

1.2 檢測指標

1.2.1 機械性觸誘發痛的測定于術前及術后6 h、1 d、3 d、7 d固定時間段測定，使用Von Frey纖維刺激大鼠左后肢足底，觀察是否出現縮足反應。大鼠出現快速的縮足反應，記為陽性反應，而身體活動所引起的縮足反應不記作陽性反應。每隔5 s測一次，連測10次，誘發4～6次縮足的閾值作為50%反應率。

1.2.2 Bcl-2和Bax的檢測實驗動物分別于術前及術后6 h、1 d、3 d、7 d麻醉后心臟插管灌流固定，然后取L4-6段脊髓組織固定、石蠟包埋后連續切片。取各時間點標本做免疫組化染色檢測Bcl-2和Bax表達，觀察Bcl-2和Bax在細胞內表達及計算陽性率。

1.2.3 TUNEL法檢測脊髓神經元凋亡取各時間點石蠟切片用TUNEL試劑盒檢測凋亡神經元，具體操作方法按試劑盒說明書進行，分析脊髓凋亡神經元并計算凋亡指數(AI＝凋亡細胞核數/總細胞核數×100%)。

2 結果

2.1 坐骨神經結扎后的痛覺變化如表1所示，A組及B組大鼠于術后6 h即出現機械性觸誘發痛，形成神經病理性疼痛；A組大鼠坐骨神經結扎后各時間點疼痛閾值持續降低，與術前比較差異有統計學意義(P＜0.05)；而B組疼痛閾值在術后3 d時達到最低值，之后緩慢回升，至術后7 d與術前已無明顯差別。由此可以觀察出阿魏酸鈉能夠減輕一定程度的疼痛。

表1 各組大鼠左側坐骨神經結扎后疼痛閾值的變化(g，)

表1 各組大鼠左側坐骨神經結扎后疼痛閾值的變化(g，)

注：與術前相比較，*P＜0.05；B組與A組相比較，▼P＜0.05。

A組B組14.60±0.55 14.67±0.58 10.33±1.53*10.90±0.98*5.00±1.00*6.80±1.37*2.28±0.99*5.65±1.23*▼1.36±0.36*13.51±1.10▼

2.2 神經元凋亡變化坐骨神經結扎后，A組和B組大鼠脊髓組織中凋亡神經元顯著增多，而且均于術后3 d達到高峰，之后逐漸降低，但是B組各個時間點陽性神經細胞明顯少于A組，兩組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)，由此可見阿魏酸鈉可抑制坐骨神經結扎后脊髓神經元的凋亡，見表2。。

2.3 脊髓Bcl-2和Bax表達的變化見表3和表4。坐骨神經結扎后，A組和B組大鼠脊髓組織中Bcl-2和Bax表達均增加，于術后3 d達到高峰，之后逐漸降低，但是B組Bax陽性神經細胞明顯少于A組，兩組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)，而B組Bcl-2陽性神經細胞明顯多于A組，表明阿魏酸鈉抑制了坐骨神經結扎后大鼠脊髓中Bax的表達，而促進了Bcl-2的表達。

表2 各組大鼠坐骨神經結扎后脊髓神經元凋亡指數(%，)

表2 各組大鼠坐骨神經結扎后脊髓神經元凋亡指數(%，)

注：與術前相比較，*P＜0.05；B組與A組相比較，▼P＜0.05。

A組B組8.24±1.69 8.56±2.53 16.70±0.75*10.51±1.62*▼30.54±4.44*20.05±3.68*▼75.12±3.91*35.18±3.26*▼12.78±2.59*8.60±2.17▼

表3 各組大鼠坐骨神經結扎后脊髓Bcl-2的變化(%，)

表3 各組大鼠坐骨神經結扎后脊髓Bcl-2的變化(%，)

注：與術前相比較，*P＜0.05；B組與A組相比較，▼P＜0.05。

A組B組28.90±3.51 27.12±5.25 27.63±6.11 38.58±8.63*▼36.35±5.11*50.27±8.46*▼50.81±8.63b*68.74±9.26*▼25.73±8.33 35.72±8.24*▼

表4 各組大鼠坐骨神經結扎后脊髓Bax的變化(%,)

表4 各組大鼠坐骨神經結扎后脊髓Bax的變化(%,)

注：與術前相比較，*P＜0.05；B組與A組相比較，▼P＜0.05。

A組B組14.64±6.52 15.25±6.27 26.53±7.42*15.98±4.67c▼35.75±9.63*20.23±6.53*▼40.52±7.89*22.74±5.47*▼17.96±6.61 14.28±5.36

3 討論

在本研究中，我們觀察到結扎大鼠坐骨神經后可造成神經病理性疼痛，其脊髓中有一定數量的神經元凋亡，而腹腔注射阿魏酸鈉可以減輕神經病理性疼痛，減少大鼠脊髓神經元的凋亡，并且可以促進Bcl-2的表達和抑制Bax的表達，對脊髓有保護作用。

阿魏酸鈉抗神經細胞凋亡的機制比較復雜，有研究[3-5]表明，神經細胞凋亡是受基因調控的，已知與神經元凋亡相關的基因有：Bcl-2基因家族、p53基因家族、早期快速反應基因家族(c-fos和c-jun)等，各種基因在細胞凋亡中的作用各不相同：如p53基因野生型對神經細胞凋亡有促進作用，c-fos可誘導其他基因(遲發性基因)表達增加并參與對神經元凋亡的調控。Bcl-2家族可以分為兩類：一類是抗細胞凋亡基因，其代表是Bcl-2基因，可抑制脊髓損傷后各種途徑的凋亡[6]，可使實驗動物過度表達Bcl-2而減輕神經損傷，提高組織對抗損傷的功能，促進軸索向外生長及損傷的中樞神經系統組織修復，并有效阻止神經細胞凋亡[7-8]；另一類是促細胞凋亡基因，其代表是Bax基因，它是Bcl-2的拮抗基因，通過編碼相應功能蛋白而起作用[9]，Bax存在于胞漿中，接受凋亡信息后能夠被激活，之后通過末端疏水結構域錨定在線粒體膜上，使線粒體通透性發生改變致使細胞色素C、凋亡誘導因子和凋亡蛋白酶激活因子-1釋放，進而激活caspase系統，促使細胞發生凋亡[10]。有研究證明[11]Bcl-2與Bax的表達強度直接或間接影響脊髓神經細胞凋亡，且凋亡程度與其比值相關。在本研究中我們觀察出，阿魏酸鈉促進抗細胞凋亡基因Bcl-2的表達，同時還抑制了促細胞凋亡基因Bax的表達，從而抑制了脊髓神經元的凋亡。

總之，阿魏酸鈉可抑制大鼠坐骨神經結扎后脊髓神經元的凋亡，減輕神經病理性疼痛，對脊髓具有保護作用，其調控機制可能與Bcl-2基因家族有關，其具體機制有待進一步研究。

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Influence of sodium ferulate on the expression of Bcl-2 and Bax in the spinal cord neurons in rats with neuropathic pain.

XIE Xiao-li1,ZHOU Qing-shan2,CHEN Zhou1.1.Department of Anesthesiology,People's Hospitalof Zhongshan City,Zhongshan 528403,Guangdong,CHINA;2.Department of Anesthesiology,Wuhan University Renmin Hospital,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo observe the influence of sodium ferulate(SF)on the expression of Bcl-2 and Bax in spinal cord neurons in rats with neuropathic pain,and to study the protective effects of SF on the spinal cord neurons in rats.MethodsSixty healthy adult male wistar rats were simply randomized into two groups:group A(n=30) and group B(n=30).The left sciatic nerves of the rats were ligated under chloral hydrate anesthesia,then the rats were given 2 ml normal saline(group A)and 100 mg·kg-1·d-1SF(group B),which was dissolved in 2 ml normal saline respectively after operation.All the patients were tested for the time of paw withdraw by using the von Frey test before surgery,6 hours,1 day,3 days,and 7 days after surgery.Apoptosis of spinal cord neurons was detected with the TUNEL method.Changes of Bcl-2 and Bax expression in the spinal cord were detected through the immunohistochemical methods and image analysis.ResultsMechanical allodynia developed at 6 hours after sciatic nerve ligation.The expression of neuronal apoptosis,Bcl-2 and Bax were first detected in spinal cord at 6 hours after injury and thereafter,reaching the peak at 3 days.The spinal neuronal apoptotic index and the expression of Bax in group B was significantly lower than that in group A.However,the expression of Bcl-2 in group B was significantly higher than that in group A(P＜0.05).ConclusionThrough promoting the expression of Bcl-2 and inhibiting the expression of Bax,sodium ferulate can effectively inhibit spinal neuronal apoptosis and protect spinal cord neurons in rats,

Sodium ferulate;Spinal cord protection;Bcl-2;Bax

R-332

A

1003—6350(2012)08—016—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.08.007

2011-09-06)

解小麗(1979—)，女，湖北省棗陽市人，主治醫師，碩士，主要從事臨床疼痛診療工作。