雞馬立克氏病的診斷

王雪松 李常國

（遼寧省食品藥品檢驗所，沈陽 110023）

馬立克氏病（MD）是最常見的一種雞淋巴組織增生性傳染病。它是由馬立克氏病毒（MDV）引起雞的一種高度接觸性傳染性腫瘤疾病，以淋巴組織的增生和腫瘤形成為特征。馬立克氏病是危害世界養禽業最嚴重的病毒性腫瘤性傳染病。MD經羽毛囊排毒，空氣傳播，傳染力極強，是雞的3大主要疫病之一。該病于1907年由匈牙利病理學家Joseph Marek首先報道，1961年在英國科學家Biggs的倡導下，開始使用馬立克病這一名稱。MD存在于世界所有養禽的國家和地區，其危害隨著養雞業的集約化而增大，此病一旦發生，即可引起雞大批死亡，給養雞業造成嚴重的經濟損失。MD是一種高度接觸性疾病，通過直接或間接接觸傳播，也可通過空氣傳播。

在實習期間，我們確診4例MD。病雞大多表現為精神不振，食欲減退，羽毛松散，縮頭耷翅，雞冠和肉髯蒼白萎縮，貧血，排水樣稀便及黃白色或黃綠色下痢。病雞消瘦迅速，體重減輕，昏迷，最后衰竭死亡。通過剖檢變化，病理組織學觀察以及瓊脂擴散試驗，在與其他癥狀相似的疾病相鑒別后，最后確診為雞馬立克氏病。

MD主要侵害外周神經系統，以周圍神經、性腺、虹膜、內臟器官、肌肉和皮膚的單獨或多發的單核細胞浸潤為特征[1]。該病具有高度傳染性，也是一種免疫抑制性疾病[2]。

MDV在細胞培養條件下呈一種嚴格細胞結合狀態，MD的病原是在1967年由Churchill和Biggs．通過體外增殖和后來從MD腫瘤細胞分離獲得皰疹病毒才得以確定的。目前，將MDV毒株分為3個血清型。其中，引起腫瘤的MDV毒株被歸為l型，天然不致瘤的MDV為2型，而HVT毒株為3型[3]。

目前，采用免疫雞群攻毒保護試驗來判定MDV毒力的強弱，將血清l型MDV分為四種病原型，即溫和型（mMDV）、強毒型（vMDV）、超強毒型（vvMDV）、特超強毒型（vv+MDV），其中每種致病型都有特定的臨床癥狀[4]。

MD是目前已知的唯一可用疫苗成功預防的病毒性腫瘤病，因而在比較醫學上，它是研究病毒性腫瘤的發生和預防機制的理想的動物模型。MDV是一群細胞結合型的皰疹病毒科的成員，在感染細胞內可見85～l00 nm的無囊膜病毒粒子，稱為核衣殼。MDV的基因組成雙股線形DNA，長度約為180 kb，裸露的病毒DNA對單層細胞和易感雞都有感染性。MD的發生和嚴重程度，取決于病原、宿主和環境，這3者密切相關[5]。

本病無特效藥物治療，只能依靠免疫預防。也許只有時間才能告訴我們目前家禽業所采取的措施能否會給發生突變的MDV得以逃逸及增強其毒力的機會[7]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 病料 撫順地區某農戶送檢的病死雞5只。

1.1.2 試劑 MD陽性血清、MD沉淀抗原、甲醛、酒精（95%）、二甲苯、石蠟、甘油、蘇木素、鉀明礬、鉀明礬、曙紅、NACL。

1.1.3 實驗儀器 顯微鏡、電熱恒溫培養箱、切片機、水浴鍋、座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器、微量移液器、電爐、平皿、架盤藥物天平、砝碼、藥匙、量筒、燒杯、玻璃棒、紗布、漏斗、毛刷、剪子、手術刀、鑷子、載玻片、蓋玻片、木塊、廢液缸、酒精燈、濾紙、樹膠、新鮮蛋白等。

1.1.4 瓊脂擴散試驗平板制作 首先稱取1g瓊脂粉，加至100mL8.5% 的高滲鹽水中，煮沸使之溶解（在電爐子上加熱，邊加熱邊攪拌，直到溶液由渾濁變澄清為止）。然后待溶解的瓊脂溫度降至55℃左右時，將其倒入滅菌清潔的平皿中，厚度約2 mm。在瓊脂凝固后，用打孔器在瓊脂凝膠上打梅花孔。一般的打孔器有 7個孔，中心孔孔徑為3 mm，周邊孔孔徑為3ml，孔距為3 ml。孔內的瓊脂如未吸出，則用注射器針頭挑出。最后將平皿在酒精燈上烘烤背面（溫度不宜過高，以不燙手為宜）使瓊脂與平皿貼緊。

1.1.5 試劑配制

固定液配制：福爾馬林液

福爾馬林（37%-40%甲醛）：100 ml 常水：500 ml蘇木素染液：

第1液配方：蘇木素1 g、無水酒精10 ml。第2液配方：鉀明礬 20 g、蒸餾水200 ml。

第1液和第2液分別配制，第2液經過過濾后加入第1液中，盛染液的瓶口蓋上紗布，置應用于日光下照射約2周，經過過濾后可以使用。

伊紅水溶液的配制：伊紅（水溶性）1 g、蒸餾水100 ml， 混合后溶解即可應用，密封保存。

1%鹽酸酒精液的配制：70%的酒精100 ml、濃鹽酸1 ml。

1.2 實驗方法

1.2.1 病理剖檢

將送檢的病例進行尸體剖檢，外部檢查之后用清水將禽體羽毛浸濕，切開大腿與腹側連接的皮膚，用力將兩大腿向外翻壓直到兩髖關節脫臼，使禽體背臥位平躺。在泄殖孔前的皮膚作一條橫切線，由此切線中部沿腹中線由后向前剪開皮膚，直到喙角，使腹部和胸部皮膚分離，進行臨床剖檢診斷。

在對臨床癥狀、尸體剖檢的基礎上，從待檢雞的背部、翅尖、尾尖拔取含有羽髓豐富的羽毛供實驗室檢驗，以尋求確診。

1.2.2 瓊脂擴散試驗

采集羽髓：從被檢雞的羽毛豐厚處拔下羽毛，從羽根尖端剪下1 cm左右的一段，注意要露出羽髓。

加樣：取瓊脂平板1個，將瓊脂平板6個孔編號，分別取5根露出羽髓的羽根，直接將其插入外周1、2、3、4、5孔中，外周的第6孔中用微量移液器加入MD標準抗原，向中心孔中加入標準陽性血清。然后將加樣完畢的瓊脂板加蓋平放于帶蓋的濕盒內，置37℃溫箱中，24 h內觀察結果。

結果判定：被檢材料與中心陽性血清空之間形成清晰的沉淀線則判為陽性，否則即為陰性。

1.2.3 病理組織學觀察

取材固定；脫水透明；浸蠟包埋；切片貼片；修整展片；H·E染色。

2 結果與分析

2.1 病理解剖學變化

組織器官：皮膚表面出現多個、大小不等的、灰白色的腫瘤結節；心臟：表面有大小的灰白色結節，稍突出于心臟表面；肝臟：明顯腫大，表面有白色小結節；脾臟：彌散性腫大；腎臟：彌漫性腫大并呈灰白色；腺胃壁：增厚。可參考圖1所示變化。

圖1 肝臟明顯腫大，表面有白色腫瘤結節

2.2 瓊脂擴散試驗

羽髓瓊脂擴散試驗結果詳見圖2。

從圖2可以看出，外周2、3、4、5、6孔的羽髓與中央的陽性血清之間均形成清晰的灰白色沉淀線，證明2、3、4、5這4根羽髓的AGP試驗為陽性，1孔未形成沉淀線，為AGP試驗陰性，而6孔為標準陽性抗原對照，檢測結果也為陽性。

圖2 瓊脂擴散試驗結果

2.3 病理組織學觀察

2.2.1 心臟 心肌纖維顆粒變性、水泡變性。在血管周圍、肌纖維間、心外膜下有淋巴細胞呈浸潤性增生。肌纖維脂肪變性，局部蠟樣壞死。

2.2.2 脾臟 鞘動脈周圍、淋巴小結出現大量淋巴細胞、網狀細胞。淋巴細胞核碎裂、邊集，并見核分裂相。

2.2.3 肝臟 肝細胞顆粒變性、水泡變性、部分壞死。竇周隙狹窄，散在少量的紅細胞和淋巴細胞，狄氏隙擴張。中、小淋巴細胞、網狀細胞在靜脈周圍浸潤。在肝小葉內局灶性增生。增生灶內有呈空泡狀的原始網狀細胞和核邊集的凋亡淋巴細胞。肝細胞壞死處有淋巴細胞集聚（詳見圖3）。

2.2.4 腎臟 腎小球體積增大。腎小囊腔狹窄。并有血紅蛋白樣物質。腎小囊壁上皮細胞腫脹。局部腎小球萎縮，出現代償性增大。腎小管上皮細胞從顆粒變性、水泡變性到細胞壞死、胞膜破裂，整個腎小管呈均質紅染。腎小管內有血紅蛋白樣物質，呈尿管型（詳見圖4）。

2.2.5 坐骨神經 神經纖維間水腫液內散在中小淋巴細胞及漿細胞。局部灶性增生。

2.2.6 卵巢 皮質和髓質見有結節性或彌漫性網狀細胞、淋巴細胞集聚。淋巴細胞核顯分裂相，局灶性增生細胞排列呈渦漩狀。部分卵泡全部被多形態淋巴細胞所代替。

2.2.7 腺胃 腺小管腺細胞開始呈顆粒變性、水泡變性，逐漸壞死，腺小管內散在流失的胞漿。淋巴細胞和網狀細胞在腺小管間、肌層間、漿膜下浸潤和增生。

2.2.8 十二指腸 肌層肌細胞和腸絨毛上皮細胞變性、壞死。漿膜、漿膜下、肌層、腸腺間和絨毛固有層出現不同程度的大中小淋巴細胞浸潤和增生。腸腺間有網狀細胞增生。

2.2.9 肺 血管內、外散在淋巴細胞。血管周圍肺小葉間隔有少量的淋巴細胞浸潤，局部肺泡間隔及支氣管周圍充滿大量的大中小淋巴細胞、少量的網狀細胞。肺小葉內充滿淋巴細胞、紅細胞，局部實質內全被腫瘤細胞代替。

圖3 肝細胞管內有多形態的淋巴細胞浸潤

圖4 腎小管之間見數量不等淋巴細胞浸潤

3 結論與討論

3.1 羽囊瓊脂擴散試驗

3.1.1 試驗原理 羽囊瓊脂擴散試驗是沉淀反應試驗的一種，以瓊脂凝膠作為載體，在1%以下的瓊脂凝膠中可形成大于85 nm的微孔，可溶性抗原或抗體能在其中自由擴散，并由近及遠形成濃度梯度。抗原和抗體在比例適當處相遇，形成顆粒較大的抗原-抗體復合物而不再擴散，出現肉眼可見的白色沉淀線。一種抗原抗體系統只出現一條沉淀線，復合抗原中的多種抗原抗體系統均可以根據自己的濃度、擴散系數、最適比等因素，形成自己的沉淀線。

3.1.2 試驗特點 羽囊瓊脂擴散試驗不需要精密的儀器且操作簡單，技術上易掌握，在我國目前條件下比熒光抗體技術和免疫電泳等易于在基層獸醫站或檢驗室推廣應用。羽囊瓊脂擴散試驗所形成的沉淀線不但易于攝影記錄，并可經染色后做永久標本。在與補體結合試驗的比較中，羽囊瓊脂擴散試驗的陽性檢出率要高于補體結合試驗；應用本試驗可以在同一個平皿中同時檢測多種抗原或抗體，并可就反應后形成沉淀線的多少來辨識抗原是否純凈，因此適用于分析多種抗原成分的材料。應用瓊脂擴散試驗的缺點是試驗過程中容易出現假陽性。

3.1.3 注意事項 應多拔幾根新羽來檢查；加樣時，以把孔加滿為度，切忌樣品溢出，影響判定結果；與鄰接孔連片時應作廢處理；MD陽性血清避免反復凍融，以防降低效價而影響檢出結果；在瓊脂擴散試驗時，還要注意羽囊同時緣孔緊密吻合，防止羽囊徑小，邊緣孔大，否則抗原擴散不充分，降低查檢率。

3.2 病理組織學觀察

3.2.1 組織固定 用于組織固定的材料必須新鮮，采集和分割后要立刻固定，不得延誤；固定材料體積的大小，以不超過直徑5 mm為準，材料與固定液的比例，以1∶20為準；所用固定液以新配的為好，并放置在陰涼處，不要在日光下直曬；材料固定完畢后，必須在容器外貼上標簽，以防止相互混淆。

3.2.2 組織脫水 組織脫水是在低濃度酒精中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體；在高濃度酒精中，每級停留時間也不宜太長，否則可使組織收縮變脆，影響切片；脫水應徹底干凈，否則與二甲苯混合后，將呈乳白色渾濁，雖然可以倒回重脫，但效果不好；如需過夜，應停留在70%酒精中。

3.2.3 組織塊透明 組織塊透明時要注意二甲苯極易揮發，故在切片透明之后，從染色缸中取出封藏，手續要敏捷，不宜久置，否則待二甲苯揮發干凈后，組織就會變硬發白，即使再加樹膠封藏，由于樹膠不能浸入組織，封后也無用處；二甲苯極易吸收空氣中的水分，故在濕度大的天氣，貯有二甲苯的染色缸的蓋子周緣可涂少許凡士林，以防止水分的滲入。在封片時也不宜將口鼻過分靠近切片，以免水氣侵入，出現白色云霧狀；二甲苯必須保持無水無酸。若用1～2滴石蠟油滴入其中，立即出現云霧狀，即表示其中已含有水分，不能再用。

3.2.4 石蠟切片制作 檢驗過程中，石蠟切片制作出現了材料裂隙、破碎的情況，請做類似試驗時借鑒。

3.6 結論

（1）本試驗對一起疑似馬立克氏病的病死雞進行臨床剖檢診斷，初步確診為雞馬立克氏病。

（2）在臨床診斷的基礎上又進行了羽囊瓊脂擴散試驗和病理組織學診斷。瓊脂擴散試驗結果表明，被檢的5份病料中，4分為陽性，1份為陰性。

（3）通過對病雞的各臟器進行病理組織學觀察檢測結果表明，各臟器具備典型的馬立克氏病的病理組織學變化。

[1] 金春富，趙福奎，吳常義.雞馬立克氏病的診斷及綜合防制[J].畜牧獸醫科技信息，2010，（1）：79

[2] 霍擊斯塔著．胡祥壁譯．禽病學（上冊）[M].第2版.中國農業大學出版社.1983：459-470

[3] 姜景才.雞的幾種免疫抑制病的癥狀及影響[J].養殖技術顧問[J]，2009，（6）：120

[4] 左天榮，趙子軼，韋平.一株具有急性致瘤特性的馬立克氏病病毒的分離與鑒定[J].病毒學報， 2007，23（3）：16-18

[5] 張振旭，王樹巖，張文靜.馬立克氏病的癥狀與防制方法[J]養殖技術顧問.2009.（4）：65

[6] 唐耀平，皮紹娣，曾榮.雞馬立克氏病的診斷與防制[J].湖南畜牧獸醫.2004，（2）：24-28

[7] 韋平.馬立克氏病研究的最新動態——第八屆國陳馬立克氏病研討會概況[J].中國家禽，2008，30（17）：6-14

[8] 王林，劉青，徐希水.雞三種腫瘤性疾病的鑒別診斷及預防措施[J].家禽科學，2008，（2）：30-31

[9] 仇建華，胡瑛瑛，宋卓.以神經癥狀為主的雞傳染病的比較與鑒別[J].黑龍江畜牧醫，2005，（6）：39-40

[10] 張丁華，王艷豐.從侵害部位鑒別診斷雞腿部疾患及其防治措施[J].中國家禽，2005，27（7）：27-28

[11] 王永，韓干身.表現面部腫脹癥狀的雞病鑒別診斷[J]，養殖與飼料，2006，（8）：42-48

[12] 邵洪澤.馬立克氏病的診斷與防制[J].獸醫導刊，2008，（9）：31-32

[13] 陳世亮.雞馬立克病的防治[J].獸藥與飼料添加劑，2006，11（4）：36

[14] 王忠山.馬立克氏病研究概述[J].福建畜牧獸醫，2009，31（3）：26-28

[15] 龔振華，李葳，劉國慶.淺談馬立克氏病防治研究進展[J].中國動物檢疫.2009，26（8）：66-69