低氧應(yīng)激對(duì)人肝癌細(xì)胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9表達(dá)的影響

吳之浩

（義烏市中心醫(yī)院 普外一科， 浙江 金華 322000）

低氧是實(shí)體瘤局部微環(huán)境的特征之一。低氧時(shí)，腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡性生物學(xué)行為改變：糖酵解途徑、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，對(duì)放化療不敏感等[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)，低氧應(yīng)激促進(jìn)人HepG-2細(xì)胞黏附、侵襲和遷移[2]。本研究模擬肝癌低氧微環(huán)境，探討低氧應(yīng)激對(duì)人HepG-2細(xì)胞甲胎蛋白（AFP）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）-1、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑 人肝癌細(xì)胞株HepG-2引自蘭州軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)科（來源于美國(guó)國(guó)立腫瘤研究所）， 胎牛血清為杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品，RT-PCR Kit 購于Takara公司，Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品。MMP-9、TIMP-1、VEGF ELISA試劑盒、AFP放射免疫試劑盒由上海生物制品研究所提供。

1.2 體外細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 HepG-2細(xì)胞置滅活10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～5天傳代一次。低氧組HepG-2細(xì)胞置37 ℃、5% O2、5% CO2、90% N2三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3 HepG-2細(xì)胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9 mRNA表達(dá)量的測(cè)定 Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，電泳見28 s、18 s條帶，以2.5μg總RNA為模板，以Takara公司的Random premier為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。根據(jù)Genebank中人AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9及β-actin mRNA序列，用primer premier5.0計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)引物（引物由Invitrogen公司合成，引物序列見表1）。優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，分別進(jìn)行AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9與β-actin共擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像儀攝片，用IamgeMaster Total v1.01軟件半定量分析各條帶面積，計(jì)算各目的基因與內(nèi)參照β-ac-tin的光密度比值表示各目的基因的mRNA表達(dá)量。

表1 人AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9及β-actin引物設(shè)計(jì)

1.4 HepG-2細(xì)胞培養(yǎng)上清AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9含量的測(cè)定 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞，按每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，常氧、低氧組HepG-2細(xì)胞于常氧、低氧培養(yǎng)24 h；吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)1000 r/min離心15 min，取上清；放射免疫測(cè)定法測(cè)定AFP，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定VEGF、TIMP-1、MMP-9含量，均嚴(yán)格按試劑盒說明操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HepG-2細(xì)胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的表達(dá) 常氧、低氧組總RNA的28 s和18 s條帶比值為2:1，表明所提取的總RNA完整性好，可用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。圖1和表2顯示：低氧組AFP、VEGF、MMP-9蛋白及mRNA的表達(dá)顯著高于常氧組，TIMP-1蛋白及mRNA的表達(dá)顯著低于常氧組（均P＜0.01）。

圖1 HepG-2細(xì)胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9 mRNA表達(dá)

表2 各組人HepG-2細(xì)胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的表達(dá)（n=8±s）

表2 各組人HepG-2細(xì)胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的表達(dá)（n=8±s）

與常氧組比：aP＜0.01

)常氧組 0.33±0.06144.68±7.30 0.42±0.0526.17±3.38 0.58±0.06 51.45±6.83 0.30±0.0466.24±4.20低氧組 0.57±0.05a187.93±5.60a0.59±0.06a52.70±4.03a0.29±0.04a30.44±7.12a 0.50±0.05a89.76±4.62a

2.2 HepG-2細(xì)胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的相關(guān)性 VEGF mRNA與AFP、MMP-9 mRNA呈正相關(guān)（r=0.820、0.878，P＜0.01），與TIMP-1 mRNA呈負(fù)相關(guān)（r=-0.880，P＜0.01）；AFP mRNA與MMP-9 mRNA呈正相關(guān)（r=0.830，P＜0.01），與TIMP-1 mRNA呈負(fù)相關(guān)（r=-0.722，P＜0.01）；MMP-9 mRNA與TIMP-1 mRNA呈負(fù)相關(guān)（r=-0.835，P＜0.01）；VEGF蛋白與AFP、MMP-9蛋白呈正相關(guān)（r=0.923、0.876，P＜0.01），與TIMP-1蛋白負(fù)相關(guān)（r=-0.771，P＜0.01），AFP蛋白與MMP-9蛋白呈正相關(guān)（r=0.917，P＜0.01），與TIMP-1蛋白負(fù)相關(guān)（r=-0.848，P＜0.01），MMP-9蛋白與TIMP-1蛋白負(fù)相關(guān)（r=-0.863，P＜0.01）。

3 討論

低氧是實(shí)體瘤局部微環(huán)境的特征之一。低氧時(shí)低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α基因表達(dá)上調(diào)，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)與HIF-1β形成異二聚體HIF-1。HIF-1與靶基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上的低氧反應(yīng)元件（hypoxia response element，HRE）5’-ACGTGC-3’結(jié)合，上調(diào)靶基因的表達(dá)并介導(dǎo)一系列腫瘤細(xì)胞對(duì)低氧的反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡性生物學(xué)行為改變：糖酵解途徑、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，對(duì)放化療不敏感等[1]。VEGF[3]、MMP-9[4]是HIF-1的靶基因，啟動(dòng)子上存在HIF-1結(jié)合位點(diǎn)HRE。VEGF基因表達(dá)上調(diào)促進(jìn)腫瘤血管新生[3]，同時(shí)也是一種免疫調(diào)節(jié)因子，能夠削弱樹突狀細(xì)胞功能而降低宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)[3]。MMP-9（明膠酶B）屬于高度保守的Zn2+依賴的內(nèi)切蛋白水解酶家族，可降解明膠和IV、V、VII、X型基底膜膠原和細(xì)胞外基質(zhì)，TIMP-1能選擇性結(jié)合MMP-9活性中心的Zn2+，封閉其催化活性，從而特異性地抑制MMP-9的活性[5]。通常情況下，組織中MMP-9和TIMP-1之間保持著相對(duì)平衡狀態(tài)，它們的平衡和相互影響決定著細(xì)胞基質(zhì)是降解還是聚集和腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[6]。本實(shí)驗(yàn)顯示：低氧應(yīng)激上調(diào)HepG-2細(xì)胞VEGF基因的表達(dá)，與文獻(xiàn)[1]研究結(jié)果一致；上調(diào)MMP-9基因的表達(dá)，與文獻(xiàn)[4]研究結(jié)果一致；下調(diào)TIMP-1基因的表達(dá)。低氧應(yīng)激上調(diào)HepG-2細(xì)胞MMP-9基因的表達(dá)、下調(diào)TIMP-1基因的表達(dá)，可能是低氧下肝癌細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)的機(jī)制之一。

AFP基因?qū)儆诎椎鞍谆蚣易澹腥齻€(gè)增強(qiáng)子，是原發(fā)性肝細(xì)胞癌診斷的重要血清標(biāo)記物，參與細(xì)胞增殖和代謝的調(diào)節(jié)，能促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[7]。本實(shí)驗(yàn)顯示：低氧應(yīng)激上調(diào)HepG-2細(xì)胞AFP基因的表達(dá)。賀濤等[8]研究提示：沉默AFP基因可抑制肝癌細(xì)胞的增殖活性。低氧應(yīng)激上調(diào)HepG-2細(xì)胞AFP基因的表達(dá)可能是低氧下肝癌細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)的機(jī)制之一。

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