高效液相色譜法測定酸模各部位大黃素含量

黃愛芳，林崇良，蔡進章，林觀樣

（1.溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 藥劑科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院 藥劑科，浙江溫州 325003）

酸模（Rumex acetosa L.）為蓼科植物，全草均可入藥。主要功能有涼血、解毒、通便、殺蟲?，F(xiàn)代藥學研究表明其具有抑菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和抗感染作用，以及對心血管和肝臟功能的調(diào)節(jié)作用[1]。酸模主要含大黃素、大黃素甲醚、大黃酚、白藜蘆醇、酸模素等化學成分[2]。大黃素具有廣泛的生物活性，具有抗菌抗病毒、抗感染、改善肝腎功能、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等作用[3]。為更好地控制藥材的質(zhì)量，本實驗對酸模不同藥用部位進行大黃素含量測定。

1 材料

1.1 儀器 美國Agilent 1100系列液相色譜儀（四元泵），紫外檢測器；UPWS超純水器（杭州永潔達凈化科技有限公司）；TU-1901紫外分光光度計（北京普析通用）；KQ-5000DE型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑和藥品 大黃素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：756-8902）；甲醇為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。藥材樣品采自溫州瑞安荊谷鄉(xiāng)，經(jīng)溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院藥劑科林觀樣老師鑒定為蓼科酸模。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Zorbax Ecilpse XDB-C18（4.6 mm×150.0 mm，5μm）；流動相為甲醇：1%冰醋酸=70:30（V:V）；流速：1.5 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：20μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取大黃素對照品5.0 mg，以甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，配成500μg·mL-1的溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取新鮮酸模根、根莖與葉適量于10 ℃陰干。精密稱取根、根莖和葉各5 g研細，置于100 mL具塞錐形瓶中。加入甲醇25 mL，稱定，50 ℃超聲提取30 min，冷卻，再稱定，以甲醇補足損失的質(zhì)量。取1 mL上清液，8000 r/min離心15 min，取上清液600μL備用。

2.4 線性關(guān)系考察 取500μg·mL-1的對照品溶液，用甲醇稀釋為500、200、50、10、5、1μg·mL-1，按上述色譜條件測定，每個濃度重復(fù)3次，進樣量為20μL。以對照品峰面積積分值為縱坐標，以進樣濃度為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為：Y=24.862X+29.723（R=0.9995）。表明大黃素在1～500μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液20μL，按上述色譜條件重復(fù)進樣6次，測得大黃素峰面積積分值RSD為1.97%（n=6），表明本法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 將供試品溶液在室溫下儲存，在相同色譜條件下，精密吸取同一供試品溶液20μL，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，測定大黃素峰面積積分值，得RSD=2.34%（n=6），表明供試品溶液在試驗期間基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗 按“2.3”項制備方法平行配置同一批供試品溶液6份，分別進樣測定大黃素峰面積積分值，得RSD=2.06%（n=6）。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量（136.02 μg·mL-1）陰干酸模根莖0.5 g各6份研細，分別精密加入大黃素對照品（50μg·mL-1）10、20、30 mL，按樣品溶液制備方法以及上述色譜條件，測定大黃素峰面積，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

圖1 HPLC圖

2.9 樣品含量測定 精密稱取陰干后酸模根、根莖和葉各5 g（n=6），按“2.3”項制備方法制備供試品溶液，精密吸取20μL供試品溶液進樣，測定大黃素含量。HPLC圖見圖1，結(jié)果見表2。

表2 樣品中大黃素含量測定結(jié)果（n=6）

3 討論

3.1 流動相的選擇 預(yù)實驗中我們選擇了兩種流動相系統(tǒng)進行實驗，甲醇:0.1%磷酸=70:30（V:V）與甲醇:0.1%冰醋酸=70:30（V:V），結(jié)果均能達到滿意的分離效果，大黃素峰均達基線分離，峰型對稱。但前者出峰時間太晚，保留時間17.5 min，故選擇甲醇:0.1%冰醋酸=70:30（V:V）作為流動相。

3.2 提取方法與提取條件的選擇 通過與水提法和醇提法大黃素提取率的比對，我們選擇了超聲輔助提取法，具有實驗操作簡便，產(chǎn)物提取率高的優(yōu)點。制備供試品溶液過程中，選擇提取溶劑的種類以及超聲提取時間和溫度作為考察因素，每個因素取三個水平進行正交試驗，結(jié)果用甲醇50 ℃超聲提取30 min為最佳提取條件。離心過程低于15 min，部分樣品的上清液靜置后仍會出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象，故上清液離心時間應(yīng)不小于15 min。

3.3 大黃素含量比較 結(jié)果表明，酸模根大黃素含量為2.7204 mg·g-1，酸模根莖大黃素含量為2.5966 mg·g-1，酸模葉大黃素含量為0.058 mg·g-1，各部位大黃素含量存在差異，酸模根與根莖大黃素含量明顯高于葉中大黃素含量，具有提取價值。本實驗可為酸模藥材質(zhì)量控制提供實驗室依據(jù)。

[1] 張廣慶,趙海鵬,王振月,等. 酸模屬植物的化學成分與藥理活性研究進展[J].世界科學技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2008,10(5):86-93.

[2] 王振月,左月明,康毅華,等.毛脈酸模化學成分的研究(Ⅱ)[J].中草藥,2005,36(11):1626-1627.

[3] 丁艷,黃志華.大黃素藥理作用研究進展[J] .中國藥理與臨床,2007,23(5):236-238.