岷山紅三葉莖葉水浸液對3種植物種子萌發及幼苗生長的影響

安培坤，王引權，竇莉莉，張金林，康生福

（1．甘肅中醫學院藥學系，甘肅 蘭州730000；2．甘肅中醫學院中醫系，甘肅 蘭州730000；

3．蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州730020；4．甘肅岷歸中藥材科技有限公司，甘肅 定西748400）

紅三葉（Trifolium pratense），又叫紅荷蘭翹搖、紅車軸草，為車軸草屬叢生型短期多年生豆科牧草，原產于小亞細亞及南歐，是全世界栽培最早和最多的重要牧草之一，我國新疆、湖北和西南地區有野生種分布［1－2］。早在1944年，甘肅岷縣從美國引進栽培紅三葉，經過多年栽培馴化，經全國飼料牧草品種審定委員會審定登記，定名為岷山紅三葉（T．pratense cv．Minshan）［3］。岷山紅三葉是集草、藥為一體的優良豆科牧草和藥用植物［4］，不僅抗寒耐濕、病蟲害少，而且優質高產，其鮮草產量3萬～9萬kg·hm－2，開花期干物質粗蛋白質含量19%～75%，同時岷山紅三葉莖葉中含有0．7%～1．0%異黃酮類化合物［4］。許多研究證明，異黃酮類物質在土壤中被微生物分解形成的衍生物，對其他植物有明顯的化感抑制作用［5－6］。異黃酮等酚類物質可通過抑制受體植物細胞內酶活性，促使細胞內自由基失衡，從而導致細胞原生質膜遭到破壞［7］。同時異黃酮類化感物質能影響線粒體中腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的形成，從而抑制幼苗根的呼吸作用［8］，進一步抑制根的伸長。岷山紅三葉以種子播種繁殖生產，在種植當年種植戶通常套種一年生牧草或當季蔬菜以增加收入。然而，有關紅三葉對這些作物的化感抑制作用尚不明確。本研究選用岷山紅三葉莖葉水浸液為供體，以燕麥（Avena sativa）、披堿草（Elymus dahuricus）和小白菜（Brassica chinensis）為受體，對3種受體種子萌發及幼苗生長進行生物測定，以明確其化感效應，為減輕和防治作物連作障礙提供依據。

1 材料與方法

1．1 供試材料 供體岷山紅三葉植株采自岷縣紅三葉種植基地，受體植物燕麥和披堿草種子由蘭州大學草地農業科技學院江小雷副教授提供，小白菜種子由甘肅省武威市隴盛種業有限公司提供。燕麥、披堿草和小白菜的種子千粒重分別為28．4、4．1和3．7g。

1．2 試驗方法 供體水浸液制備：于2011年5月下旬采集初花期岷山紅三葉健康植株，立即帶回實驗室，摘除枯黃葉片，洗凈，瀝干后，剪成2cm長的小段備用。稱取80g剪碎樣，材料與水按1∶5比例，加入蒸餾水400mL，置于室溫下浸泡48h，300 W超聲儀，25℃超聲35min，用定性濾紙和0．45 μm的濾膜進行二重抽濾，即得質量濃度為0．20 g·mL－1的水浸液，儲于4℃冰箱中備用。使用時再與蒸餾水按3∶1、1∶1、1∶3比例混合，分別稀釋成0．05、0．10和0．15g·mL－1濃度的水浸液［9－11］。

供體莖葉水浸液對受體植物的生物測定：采用改進的平皿法［9］。將經0．1%HgCl消毒10min的飽滿種子各20粒，均勻播種于放有兩層滅菌濾紙的種子發芽盒中，各試驗組分別加入10mL的0．05、0．10、0．15和0．20g·mL－1的岷山紅三葉莖葉水浸液（對照組加10mL蒸餾水）后，置于（25±1）℃恒溫箱中培養，每處理重復3次。以胚根突破種皮1～2mm時記錄發芽數，小白菜處理組2d后開始記錄發芽數，4d后測量根長和芽長；燕麥和披堿草處理組分別于3、4d后開始記錄發芽數，6d后測量根長和芽長。發芽率的計算公式如下：

酚類化感物質的測定：取岷山紅三葉濾液20 mL，分別加入2%FeCl3和2%K3Fe（CN）6（體積比15∶1）混合液5mL，再加入4～5滴10%HCl溶液，調至酸性。根據溶液顏色變化判斷是否含有酚類化感物質［12－13］。

數據處理：用Excel對種子的發芽率及幼苗的根長和芽長試驗數據進行整理，用SPSS 16．0對同一植物不同濃度的岷山紅三葉水浸液處理的各試驗組指標數據進行單因素方差分析。

2 結果

2．1 岷山紅三葉莖葉水浸液中化感物質的測定 0．20g·mL－1的水浸液（A）呈黃褐色，反應液（B）呈黃色，蒸餾水加反應液（C）呈淺黃色。當在0．20g·mL－1的水浸液中加入反應液（D）時，顏色由最初的黃褐色迅速變為墨藍色（圖1）。

圖1 岷山紅三葉莖葉水浸液中酚類物質的顯色反應Fig．1 Coloring reaction between reaction liquid and phenolic compounds in aqueous extract from the stems and leaves of Trifolium pratense cv．Minshan

2．2 岷山紅三葉莖葉水浸液對植物種子萌發的影響 4種濃度的岷山紅三葉莖葉水浸液對3種受體植物種子的發芽率均無顯著影響（P＞0．05）（表1）。說明濃度小于0．20g·mL－1的岷山紅三葉莖葉水浸液對燕麥、披堿草、小白菜種子的發芽影響不顯著。

2．3 岷山紅三葉莖葉水浸液對植物幼苗生長的影響 岷山紅三葉莖葉水浸液濃度在0．10～0．20g·mL－1時，對3種受體植物幼苗根生長有顯著影響（P＜0．05），且抑制作用隨水浸液濃度的增加而增強，當水浸液濃度為0．20g·mL－1時，燕麥、披堿草和小白菜根生長抑制率分別比對照降低23．76%、35．73%和62．50%（表2）。

表1 岷山紅三葉莖葉水浸液對3種植物種子發芽率的影響Table 1 Effects of aqueous extract from the stems and leaves of Trifolium pratense cv．Minshan on seed germination rate of 3plant species %

表2 岷山紅三葉莖葉水浸液對3種植物幼苗根及胚芽長的影響Table 2 Effects of aqueous extract from the stems and leaves of Trifolium pratense cv．Minshan on the radicle and plumule length of 3plant species

不同濃度水浸液對燕麥的胚芽長無顯著影響（P＞0．05），對披堿草和小白菜芽的生長表現出不同的效應。0．05g·mL－1水浸液濃度顯著促進披堿草的胚芽生長（P＜0．05），較對照增加了11．97%，其他處理與對照相比無顯著影響。所有的處理濃度均顯著促進小白菜的胚芽生長，尤其是0．15g·mL－1時，較對照增長63．64%。

3 討論與結論

高等植物的化感物質主要是酚類、類萜、含氮化合物、聚乙炔和香豆素等次生代謝物質，其中酚類物質為重要的水溶性化感物質［12］。根據酚類物質的特性，向含酚類物質溶液中加入2%FeCl3和2%K3Fe（CN）6（體積比15∶1）試劑后，鄰位羥基酚與Fe3＋生成綠色絡合物，間位羥基酚與Fe3＋生成藍色絡合物，且溶液中酚類物質濃度越高，其與Fe3＋結合形成的絡合物量就越多，溶液顏色就越深［13］。由此可推測，岷山紅三葉化感物質中含有較多的間位酚類物質。本研究盡管定性測定出岷山紅三葉莖葉中含有較多的間位酚類物質，表明其可能為主要化感抑制物質，但岷山紅三葉中除了含有異黃酮類物質之外，還含有槲皮素（Quercetin）、水楊酸（Salicylic Acid）等酚類物質［14］，這些物質是否也有化感抑制作用，還有待于進一步明確。

本研究表明，不同植物幼苗芽的生長受岷山紅三葉莖葉水浸液的化感效應不同。各濃度對小白菜幼苗根伸長均有顯著的抑制作用，且抑制作用隨水浸液濃度的增加而增強，濃度低于0．20g·mL－1的水浸液對燕麥、披堿草、小白菜種子的萌發均無顯著影響。李志華和沈益新［11］的研究表明，紅三葉水浸液明顯降低了高羊茅種子的發芽率，對多花黑麥草（Lolium multiflorum）、白三葉（T．repeus）、紫苜蓿（Medicago sativa）和蘿卜（Raphanus sativus）的根伸長生長有明顯的抑制作用。這說明岷山紅三葉的化感作用在受體植物種屬之間存在一定的差異。當0．05g·mL－1岷山紅三葉莖葉水浸液對雙子葉植物小白菜的化感作用要比對單子葉植物燕麥、披堿草的作用更強，這可能與不同類型植物對化感物質的敏感程度不同有關，也可能因為水浸液抑制了小白菜的幼根伸長，從而導致了營養物質較多轉向幼芽，為幼芽的生長提供了更多的物質基礎，產生了幼芽生長受到促進的現象。

岷山紅三葉可多年生長，且水溶性的酚類化感物質易成鹽，所以這種酚類化感物質在自然條件下易被土壤吸收［8］。這樣是否會導致岷山紅三葉連作障礙的發生以及影響程度也有待進一步探索，此外岷山紅三葉植物中化感物質的產生、釋放及作用機制也需要進一步明確。

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