膠質(zhì)芽孢桿菌對黑麥草根際微生物數(shù)量的影響

張曉波，趙 艷

（1．海南大學農(nóng)學院，海南 海口570228；2．熱帶作物種質(zhì)資源保護與開發(fā)利用教育部重點實驗室 海南大學，海南 海口570228）

土壤是一個活的生態(tài)體系，其中土壤微生物不僅是土壤有機物轉(zhuǎn)化的執(zhí)行者，而且是植物營養(yǎng)元素的活性庫［1－2］。因此，土壤微生物在評價土壤肥力、環(huán)境監(jiān)測、評價土地利用和土壤質(zhì)量狀況等方面有廣泛的作用，可為土壤健康管理提供科學依據(jù)［3－5］。

多年生黑麥草（Lolium perenne）（以下簡稱黑麥草），具有生長速度快、產(chǎn)量高、適應性強、適口性好和營養(yǎng)價值豐富等優(yōu)點，在全國許多地區(qū)得到廣泛推廣［6］。種植黑麥草既可充分合理利用耕地資源，也可為畜牧業(yè)生產(chǎn)提供大量的優(yōu)質(zhì)青飼料，節(jié)省飼料糧，增加農(nóng)民收入［7］。近年來，許多學者主要對黑麥草進行了產(chǎn)量、養(yǎng)分等方面的研究［8－10］，而關于施用膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）菌劑對黑麥草根際土壤微生物數(shù)量影響的研究還相對較少。膠質(zhì)芽孢桿菌具有活化磷鉀礦物的能力，作為微生物鉀肥的有效成分，其在根際的定殖以及在作物生長周期保持較多的成活數(shù)量是人工接種菌劑能否有效提高作物產(chǎn)量、培肥土壤肥力等方面的重要因素［11］。為此，本試驗探討了施用膠質(zhì)芽孢桿菌菌劑對黑麥草根際土壤微生物數(shù)量的影響，以期為膠質(zhì)芽孢桿菌菌肥的研制及利用提供參考。

1 材料與方法

1．1 供試植物 黑麥草，品種為Premier，經(jīng)測定其種子發(fā)芽率達95%。

1．2 供試菌劑 本試驗所用菌株是從玉米（Zea mays）、草地早熟禾（Poa pratensis）、披堿草（Elymus dahuricus）、多 年 生 黑 麥 草、匍 匐 剪 股 穎（Agrostis palustris）根際土壤中分離篩選鑒定出的5株膠質(zhì)芽孢桿菌菌株，分別編號為菌株K02、K05、K09、K11、K12；經(jīng)擴繁、復壯制成菌液（活菌數(shù)達到2．0×109cfu·mL－1），培養(yǎng)后用滅菌草炭分別吸附各菌液（草炭∶菌液＝2∶1），混勻后晾干備用。

1．3 試驗設計 本試驗選取農(nóng)田0～20cm耕層土壤，屬黃土狀母質(zhì)發(fā)育的石灰性褐土，土壤有機質(zhì)含量22．8g·kg－1，速效氮含量22．7mg·kg－1，速效磷含量 11．8mg·kg－1，速效 鉀含量 58．3 mg·kg－1，細菌8．9×106cfu·g－1，放線菌2．3×103cfu·g－1，真菌5．3×103cfu·g－1，pH 值7．89。本試驗采用盆栽法（盆缽為直徑30cm、高27cm的聚乙烯塑料盆）進行，先在盆底部裝粉碎小石子1kg，供試土壤5kg·盆－1和菌劑50g［對照除外］，充分混勻后，為保證每盆的含水量一致，每盆澆水1L，每盆播種黑麥草種子1g。

試驗設6個處理，分別為上述5個膠質(zhì)芽孢桿菌及對照，對照為種子及土壤均不接菌的處理，每個處理設10個重復，共計60盆。

1．4 盆栽取樣及測定方法

1．4．1 土樣采集 分別在黑麥草播種后10、50和90 d，隨機選取健康黑麥草植株，將其從0～10cm土樣挖出，輕輕抖落根系外圍土，取緊貼在根表附近的土樣，將同一處理的土樣混均勻后作為根際土，備用。

1．4．2 微生物數(shù)量的測定 采用稀釋涂布平板法［12］，全過程無菌操作。細菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；放線菌用高氏一號培養(yǎng)基；真菌采用馬丁氏培養(yǎng)基。準確稱取10g已過篩（1mm）土壤，加入盛有90mL無菌水的三角瓶中，用HS260基本型振蕩儀振蕩30min（170r·min－1），得10－1土壤懸濁液，充分混勻后，立即吸取1mL懸濁液加入另一盛有9 mL無菌水的試管中，得10－2土壤懸濁液。按上述方法依次將土壤稀釋成10－3、10－4、10－5的懸濁液。

根據(jù)待分離的微生物類型，分別吸取不同稀釋倍數(shù)的土壤懸濁液（真菌10－3、放線菌10－2、細菌10－5）0．1mL，加入預先制備好的平板培養(yǎng)基上，用無菌涂布器將土壤懸浮液均勻涂布在培養(yǎng)基上，每種處理設3次重復。將培養(yǎng)基在特定溫度下（真菌25℃、放線菌28℃、細菌30℃）培養(yǎng)5～6d觀察，并統(tǒng)計菌落數(shù)目。結(jié)果以每克干土所含菌數(shù)表示［12］，按下式計算。

1．5 數(shù)據(jù)處理與分析 本試驗所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel進行計算，并利用SPSS 13．0進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

圖1 膠質(zhì)芽孢桿菌對黑麥草根際細菌數(shù)量的影響Fig．1 Effects of Bacillus mucilaginosus on the quantity of bacteria in ryegrass rhizosphere

2．1 對黑麥草根際細菌數(shù)量的影響 與對照相比，施入膠質(zhì)芽孢菌劑后各處理黑麥草根際細菌數(shù)量隨著黑麥草的生長而增加（圖1），并且均以播種后90d的細菌數(shù)量增加最多，播種后10d的細菌數(shù)量最少。其中，播種后10d各菌劑處理的黑麥草根際細菌數(shù)量與對照相比增加幅度為13．04%～44．56%，各處理細菌數(shù)量依次為 K05＞K12＞K09＞K11＞K02＞對照；播種后50d根際細菌數(shù)量與對照相比增加幅度在18．09%～60．00%，處理K05＞K12＞K11＞K09＞K02＞對照；播種后90d根際細菌數(shù)量與對照相比增加幅度為23．25%～97．67%，各處理細菌數(shù)量依次為 K05＞K12＞K09＞K11＞K02＞對照。方差分析表明，在播種后10、50、90d，黑麥草根際細菌數(shù)量均顯著高于同期對照（P＜0．05）；此外，播種后10、90d所有菌劑處理間黑麥草根際細菌數(shù)量均有顯著差異（P＜0．05）。播種50d后處理 K05、K12與 K02、K09、K11之間具有顯著差異（P＜0．05），而處理K02、K09和K11之間差異不顯著（P＞0．05）。

圖2 膠質(zhì)芽孢桿菌對黑麥草根際放線菌數(shù)量的影響Fig．2 Effects of Bacillus mucilaginosus on the quantity of actinomycete in ryegrass rhizosphere

圖3 膠質(zhì)芽孢桿菌對黑麥草根際真菌數(shù)量的影響Fig．3 Effects of Bacillus mucilaginosus on the quantity of fungi in ryegrass rhizosphere

2．2 對黑麥草根際放線菌數(shù)量的影響 與根際細菌數(shù)量類似，黑麥草根際的放線菌數(shù)量隨著黑麥草的生長而增加，各處理均以播種后90d的數(shù)量最多，10d的數(shù)量最少（圖2）；播種后10d各菌劑處理的黑麥草根際放線菌數(shù)量與對照相比增加幅度為6．89%～37．93%，各處理放線菌數(shù)量依次為K05＞K12＞K11＞K09＞K02＞對照；播種后50d根際放線菌數(shù)量與對照相比增加幅度為17．14%～62．85%，各處理放線菌數(shù)量依次為K12＞K05＞K09＞K02＞K11＞對照；播種后90d根際放線菌數(shù)量與對照相比增加幅度為37．20%～55．81%，各處理放線菌數(shù)量依次為K09＞K12＞K11＞K05＞K02＞對照。方差分析表明，在播種后10、50、90d，與對照相比，除播種后10d處理K02增加不顯著外（P＞0．05），其余處理均增加顯著（P＜0．05）；各菌劑處理間，在播種后10d處理K05、K11、K12與處理K02之間顯著差異（P＜0．05），而處理K05與處理K12、K11間差異不顯著；在播種50d后處理K05、K12與處理K02、K09、K11之間具有顯著差異（P＜0．05）；在播種后90d處理 K09、K12、K11、K05與處理K02之間差異顯著（P＜0．05），而K09、K12、K11、K05間差異不顯著。

2．3 對黑麥草根際真菌數(shù)量的影響 施用膠質(zhì)芽孢桿菌菌劑對黑麥草根際真菌數(shù)量的影響不同于細菌和放線菌的變化趨勢。在播種后10d處理K12黑麥草根際真菌的數(shù)量與對照相比增加了8．92%（圖3）；除處理K12外，其余處理根際真菌的數(shù)量與對照相比均有減少，減少幅度為3．51%～8．92%，各處理根際真菌數(shù)量依次為K02、K05＜ K09＜K11＜對照＜K12；播種后50d根際真菌的數(shù)量與對照相比減少幅度為1．37%～23．28%，各處理根際真菌數(shù)量依次為K05＜K12＜K09＜K11＜K02＜對照；播種后90d黑麥草根際真菌的數(shù)量與對照相比減少幅度為1．92%～39．42%，各處理根際真菌數(shù)量依次為K05＜K12＜K09＜K02＜K11＜對照。播種后10d除處理K12外，其余處理總的趨勢表現(xiàn)為施用膠質(zhì)芽孢桿菌菌劑對根際真菌的數(shù)量有較強的抑制作用。方差分析表明，與對照相比，在播種后10d處理K02、K05、K12差異顯著（P＜0．05），與處理K09、K12差異不顯著（P＞0．05）；在播種后50d與處理 K05、K12差異顯著（P＜0．05），與處理K02、K09、K11差異不顯著，在播種后90d與處理K02、K05、K09、K12差異顯著（P＜0．05），與處理K11差異不顯著。總體而言，施用膠質(zhì)芽孢桿菌菌劑后，3個取樣時期絕大部分處理根際真菌數(shù)量呈下降趨勢。

3 討論與結(jié)論

根際是受根系直接影響的土壤范圍，在植物的整個生長期間，根系進行著活躍的代謝作用，向根外不斷分泌有機物質(zhì)，這些分泌物是根際微生物的重要營養(yǎng)和能量來源。有研究表明，同一作物在不同生育時期營養(yǎng)狀態(tài)下，其根際微生物數(shù)量呈現(xiàn)一定的動態(tài)變化［13－14］。

本研究表明，膠質(zhì)芽孢桿菌對黑麥草不同生長時期土壤中三大類微生物數(shù)量均產(chǎn)生了影響，其中根際微生物總量在播種后90d時數(shù)量較多，另外，與對照相比，各處理根際細菌、放線菌數(shù)量增加。大量微生物的繁衍又可促進土壤有機物的分解，從而形成植物與微生物在土壤載體中的相互依存、相互促進的關系；與對照相比，除播種后10d時處理K12外，其他各處理根際真菌數(shù)量均減少，且在播種后50和90d，所有菌株處理黑麥草根際真菌數(shù)量與對照相比下降顯著；從而，總體上說明膠質(zhì)芽孢桿菌菌劑施入土壤后對黑麥草根際真菌的生長有一定的抑制作用。本研究結(jié)果與別運清和胡正嘉［15］研究硅酸鹽細菌對植物真菌有明顯抑制作用和林啟美等［16］研究在小麥（Triticwm aestivum）生長10d時膠質(zhì)芽孢桿菌對真菌的生長有較強抑制作用的結(jié)果相一致。

其他研究者關于作物連作導致土壤養(yǎng)分下降的研究也證明了隨著土壤養(yǎng)分的下降，植物根際細菌、放線菌數(shù)量下降，真菌的數(shù)量逐漸增加，根際土壤由“細菌主導型”向“真菌主導型”轉(zhuǎn)化；反之，如果土壤養(yǎng)分上升，則植物根際真菌數(shù)量下降，細菌、放線菌的數(shù)量增加，根際土壤由“真菌主導型”向“細菌主導型”轉(zhuǎn)化［17－20］。本研究中，膠質(zhì)芽孢桿菌菌劑在促進黑麥草根際細菌、放線菌數(shù)量的同時“抑制”了真菌的數(shù)量，在某種程度上也使得黑麥草根際土壤由“真菌型”向“細菌型”轉(zhuǎn)化，說明施入膠質(zhì)芽孢桿菌菌劑在一定程度上改善了黑麥草的根際環(huán)境。

［1］ Wu J，Brookes P C，Jenkinson D S．Formation and destruction of microbial biomass during the decomposition of glucose and ryegrass in soil［J］．Soil Biology and Biochemistry，1993，25：1435－1441．

［2］ Burger M，Jackson L E．Microbial immobilization of ammonium and nitrate in relation to ammonification and nitrification rates in organic and conventional cropping systems［J］．Soil Biology and Biochemistry，2003，35：29－36．

［3］ 李傳榮，許景偉，宋海燕，等．黃河三角洲灘地不同造林模式的土壤酶活性［J］．植物生態(tài)學報，2006，30（5）：802－809．

［4］ France E A．Soil chemistry changes after 27years under four tree species in southern Ontario［J］．Canadian Journal of Forest Research，1989，19（12）：1648－1650．

［5］ 邢會琴，肖占文，閆吉智，等．玉米連作對土壤微生物和土壤主要養(yǎng)分的影響［J］．草業(yè)科學，2011，28（10）：1777－1780．

［6］ 季楊，張新全，馬嘯．多花黑麥草品種間雜交及其雜種后代 SRAP遺傳分析［J］．草業(yè)學報，2009，18（4）：260－265．

［7］ 王棟．牧草學各論［M］．南京：科學技術出版社，1989：32－33．

［8］ 占麗平，魯劍巍，楊娟．施肥對黑麥草生長和產(chǎn)量的影響［J］．草業(yè)科學，2011，28（2）：260－265．

［9］ 劉經(jīng)榮，張美良，鄭群英．不同施N水平對黑麥草產(chǎn)量和品質(zhì)的效應［J］．江西農(nóng)業(yè)大學學報，2003，25（6）：844－847．

［10］ 魯劍巍，李小坤，粱友光．平衡施肥對黑麥草生長及產(chǎn)量的影響［J］．水利漁業(yè)，2004，24（2）：20－22．

［11］ 何琳燕，盛下放，陸光祥，等．不同土壤中硅酸鹽細菌生理生化特征及其解鉀活性的研究［J］．土壤，2004，36（4）：434－437．

［12］ 姚占芳，吳云漢．微生物學實驗技術［M］．北京：氣象出版社，1998：128－131．

［13］ 孫軍德，趙春燕，黃小星，等．保護地番茄根際微生物區(qū)系分析［J］．土壤通報，2005，36（6）：943－945．

［14］ 劉訓理，王超，吳凡，等．煙草根際微生物研究［J］．生態(tài)學報，2006，26（2）：552－557．

［15］ 別運清，胡正嘉．硅酸鹽細菌幾種功能的研究［J］．襄樊職業(yè)技術學院學報，2002，1（1）：12－15．

［16］ 林啟美，饒正華，孫焱鑫，等．膠質(zhì)芽孢桿菌的篩選及其對番茄營養(yǎng)的影響［J］．中國農(nóng)業(yè)科學，2002，35（1）：59－62．

［17］ 阮維斌，王敬國，張福鎖．連作障礙因素對大豆養(yǎng)分吸收和固氮作用的影響［J］．生態(tài)學報，2003，23（1）：22－29．

［18］ 王金龍，徐冉，陳存來，等．大豆連作下土壤環(huán)境條件變化的概述［J］．大豆科學，2000，19（4）：367－371．

［19］ 李瓊芳．不同連作年限麥冬根際微生物區(qū)系動態(tài)研究［J］．土壤通報，2006，37（3）：563－567．

［20］ 張鳳華，馬富裕，鄭重．不同水肥處理膜下滴灌棉田根際微生物及棉花生長發(fā)育的研究［J］．新疆農(nóng)業(yè)大學學報，2000，23（4）：56－58．