CoCl2對酸脅迫下多花黑麥草種子萌發及幼苗抗性的影響

回振龍，馬 蘭，李朝周

（1．甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州730070；2．甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州730070）

多花黑麥草（Lolium multiflorum）又名意大利黑麥草、一年生黑麥草，是具世界栽培意義的禾本科牧草，其具有生長速度快、產量高、適應性強、適口性好和營養價值豐富等優點［1－2］。而中國現正面臨著酸雨污染面積擴大、酸雨酸度增大、頻次增多、污染嚴重的困擾，這對多花黑麥草的栽培及生長發育造成嚴重的影響［3－4］。鈷是許多植物和微生物必需的微量元素之一。植物一般含有0．05～0．50 mg·L－1的鈷，豆科植物含量較高，禾本科植物含量較低［5］。反芻動物瘤胃微生物合成維生素B12也需要鈷的參與［6］，所以在畜牧業生產中要給畜禽補飼一定數量的鈷鹽，最好的方式是大面積草地小劑量噴灑［7］。而關于施鈷對酸脅迫下植物種子的萌發及幼苗生長狀況的影響還鮮見報道。本研究就CoCl2溶液浸種對酸脅迫下多花黑麥草種子的萌發及幼苗生理特性的影響進行探討，旨在進一步認識鈷在植物逆境生理生態中的作用，為中國酸雨多發區多花黑麥草的生產及畜牧業的發展提供理論支持。

1 材料與方法

1．1 試驗材料 試驗所用多花黑麥草種子由甘肅省農業科學院果樹研究所提供。

1．2 酸溶液的配制 本試驗酸溶液由分析純濃硫酸（98%）和蒸餾水混合而成。將硫酸配制成pH值為1．0的母液，用上海雷磁儀器廠生產的pH－29A型數顯酸度計測定并配制出pH值分別為3．0、4．0、5．0和5．8（蒸餾水）的酸溶液。

1．3 測定指標與方法

1．3．1 預處理 試驗前將種子用1%的次氯酸鈉溶液浸種30min消毒，然后用清水反復沖洗后備用。

1．3．2 CoCl2溶液浸種對多花黑麥草種子萌發的影響 在50mL三角瓶中分別加入不同濃度（0、0．000 5、0．002、0．01、0．1、1．0和10mmol·L－1）的CoCl2溶液各25mL。按國家種子質量檢驗標準［8］隨機抽取預處理多花黑麥草種子各300粒放入盛有不同濃度CoCl2溶液的三角瓶中，置于培養箱內暗中浸泡24h（20±2℃）。次日將盛有不同濃度CoCl2溶液浸種的多花黑麥草種子吸干表面水分后整齊擺放于鋪有兩層濾紙的培養皿內，每個培養皿中各放100粒（培養皿事先在120℃烘箱內放置4h后冷卻至室溫），每個處理水平重復3次，放入培養箱中（20±2℃）進行催芽。每天補充等體積蒸餾水以確保培養環境的濕潤。發芽以胚根長度達到種子自身長度為標準［9］，每天統計發芽的種子數。計算發芽率（8d，測試種子發芽數占測試種子總數的百分比）、發芽勢（4d，發芽過程中日發芽種子數達到最高峰時發芽的種子數占供測樣品種子數的百分率［10－11］）和根長抑制指數（正常情況下的根長減去經處理后根長的差與正常根長的比值的百分數［12］）。

1．3．3 CoCl2對酸溶液脅迫下多花黑麥草種子萌發和幼苗生長的影響 根據CoCl2溶液浸種對多花黑麥草種子萌發試驗的結果分別選取0．01和0．1 mmol·L－1的CoCl2溶液浸種24h后的多花黑麥草種子50粒，整齊擺放于鋪有兩層濾紙的培養皿內，每個培養皿中分別加入pH 值為3．0、4．0、5．0、5．8的酸溶液5mL，每個處理水平重復3次。將放有種子并加入酸溶液或蒸餾水的培養皿放入光照培養箱中（20±2℃）進行催芽。每天更換等體積相應的酸溶液以確保酸溶液的pH值不變。計算發芽率（8d）、發芽勢（4d）［10－11］、根長抑制指數［12］。于第10天對幼苗進行各項抗性生理指標的測定。

1．3．4 抗性生理指標的測定

葉綠素含量：采用丙酮顯色法［13］。用722N型分光光度計測定663、646和470nm波長下的光密度值。

丙二醛（MDA）含量：采用硫代巴比妥酸（TBA）法［13］。

超氧化物歧化酶（SOD）活性：采用分光光度法，以抑制氮藍四唑（NBT）光氧化還原一半的酶量定義為一個酶活力單位［14］。

過氧化物酶（POD）活性：采用愈創木酚比色法，以每分鐘光密度變化值表示酶活性的大小［14］。

細胞膜穩定指數（MSI）：參照Sairam 等［15］的方法。

O－2·的產生速率：參照王愛國和羅廣華［16］的方法，測定環境中的光照強度為120μmol·m－2·s－1。

H2O2含量：參照林植芳等［17］的方法。

1．4 數據處理 各項試驗重復3～5次，數據采用Excel軟件和SPSS統計分析軟件進行分析，取P＜0．05為顯著相關。

2 結果與分析

2．1 CoCl2溶液浸種及酸脅迫對多花黑麥草種子萌發的影響 除10．0mmol·L－1CoCl2溶液浸種處理顯著抑制種子萌發外，其他濃度CoCl2溶液浸種均不同程度地促進了多花黑麥草種子的萌發（表1）。當CoCl2濃度為0．01mmol·L－1時，發芽率最高，比對照增加了11．09%。

CoCl2溶液對多花黑麥草根的抑制強度隨著濃度的增加而增強，10．0mmol·L－1處理根長抑制指數為44．13%（表1），且根尖發黑。

CoCl2對酸脅迫下多花黑麥草種子萌發的影響因CoCl2溶液濃度和酸溶液酸度而異（表2）。適宜濃度CoCl2處理對酸脅迫下多花黑麥草種子的萌發有促進作用，尤以0．1mmol·L－1CoCl2的促進作用較明顯。

表1 CoCl2溶液浸種對多花黑麥草種子萌發的影響Table 1 Influences of CoCl2on germination of seeds of Lolium multiflorum

表2 CoCl2溶液浸種對酸脅迫下多花黑麥草種子萌發的影響Table 2 Influences of CoCl2on germination of seeds of Lolium multiflorumunder acid stress

從根長抑制指數的變化趨勢來看，酸溶液脅迫抑制多花黑麥草種子的生根，酸溶液酸度越大抑制作用越強（表2）。

2．2 CoCl2溶液浸種對酸脅迫下多花黑麥草幼苗生長發育的影響 酸脅迫時，0．01和0．1 mmol·L－1CoCl2對多花黑麥草芽長和地上部干質量均有一定的促進作用，且0．1mmol·L－1CoCl2的促進作用較為顯著（圖1）。

2．3 CoCl2溶液浸種對酸脅迫下多花黑麥草幼苗抗性生理的影響

2．3．1 葉綠素含量、MDA含量和 MSI CoCl2溶液浸種處理在一定程度上提高了多花黑麥草幼苗的葉綠素含量。0．1mmol·L－1CoCl2溶液對酸脅迫下幼苗葉綠素的降解具有一定的保護作用（圖2）。

0．01和0．1mmol·L－1CoCl2可在一定程度上減少MDA含量的增加，說明0．01和0．1mmol·L－1CoCl2可減少酸脅迫下幼苗脂質過氧化產物的累積（圖2）。

多花黑麥草幼苗MSI隨著酸溶液強度的增加而下降。0．01和0．1mmol·L－1CoCl2溶液處理幼苗MSI均顯著高于相同酸度對照處理（圖2）。

2．3．2 超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性 酸脅迫下多花黑麥草幼苗SOD活性隨著酸溶液酸度的增加而降低。CoCl2濃度為0．1mmol·L－1時幼苗SOD活性升高最明顯（圖3）。

酸脅迫下多花黑麥草幼苗POD活性隨著酸溶液酸性增強先升高后降低。CoCl2濃度為0．1 mmol·L－1時對酸脅迫下多花黑麥草幼苗POD活性增強的抑制作用最顯著（圖3）。

2．3．3 O－2·產生速率和H2O2含量 多花黑麥草幼苗O－2·產生速率和H2O2含量隨著酸溶液酸性的增加逐漸增大（圖4）。0．01和0．1mmol·L－1CoCl2處理抑制了酸脅迫對幼苗脂質過氧化的作用，且酸性越強其作用越明顯。

3 討論與結論

一般認為鈷并非植物必需的微量元素，就鈷是否為所有高等植物所必需尚未形成定論，但它對一些植物有積極的作用已被確定［18－19］，具體表現在適宜濃度范圍的鈷對植物種子萌發、幼苗生長具有一定的促進作用［20］；能顯著提高小麥（Triticum aestivum）籽粒和秸稈的產量［21］；刺激植物生長，穩定葉綠體［22］；對氨基酸、輔酶、蛋白質的代謝也有影響［23］。此外，鈷對植物逆境生理也表現出了一定的作用，如適量的鈷對干旱脅迫下大豆（Glycine max）幼苗葉片有一定的保護作用［24］，能夠提高干旱脅迫下紫花苜蓿（Medicago sativa）種子的萌發及幼苗的生長［25］。它也是參與和構造維生素B12特定結構的元素［26］，參與植物體呼吸作用和能量代謝，穩定葉綠素結構［27］，而且鈷表現有促進生長素和細胞分裂素形成及抑制乙烯產生的作用［19］。上述研究說明，鈷在植物生長發育及抗逆生理等方面具有一定的作用，但有關鈷對農作物或牧草品質和產量的影響并未取得一致的結果，這可能與供試土壤、鈷的使用濃度和作物類型及環境條件有很大的關系［19］。

圖1 CoCl2溶液浸種對酸脅迫下多花黑麥草芽長、地上干質量和地下干質量的影響Fig．1 Influences of CoCl2on shoot length，shoot dry weight and root dry weight of seedings of Lolium multiflorumunder acid stress

酸脅迫下鈷對牧草生長發育及抗逆生理的影響尚缺乏研究報道。本研究結果表明，CoCl2溶液浸種對多花黑麥草芽長和地上部干質量均有一定的促進作用，提高了多花黑麥草幼苗的葉綠素含量和細胞膜穩定指數，在一定程度上減少丙二醛含量的增加，增強了超氧化物歧化酶的活性，對過氧化物酶活性的增強有明顯的抑制作用，并減緩了酸脅迫對幼苗脂質過氧化的傷害。0．01和0．1mmol·L－1CoCl2都能較為有效的保護幼苗，減輕酸脅迫的傷害，但這種保護機制同時受到酸液酸度的影響，0．1 mmol·L－1CoCl2對酸溶液脅迫下多花黑麥草種子萌發及幼苗生長發育的保護作用最明顯。施用CoCl2可增強多花黑麥草幼苗的抗酸能力，緩解酸脅迫造成的傷害，其原因可能與鈷的生理功能有關，即鈷是乙烯合成重要酶——1－氨基環丙烷－1－羧酸氧化酶的抑制劑，通過抑制該酶的活性，鈷元素可顯著抑制乙烯的產生［28］。而乙烯作為植物體內具有多種生理功能的重要激素之一，在植物細胞遭受較為嚴重的傷害時，乙烯與活性氧可以相互促進對方的合成［29］。由此，通過抑制乙烯產生，鈷元素可能對酸脅迫下細胞膜的傷害起到一定的減緩作用。

圖2 CoCl2溶液浸種對酸脅迫下多花黑麥草幼苗葉綠素含量、丙二醛含量和細胞膜穩定指數的影響Fig．2 Influences of CoCl2on chlorophyll，malondialdehyde content and membrance stablility index（MSI）of seedings of Lolium multiflorumunder acid stress

圖3 CoCl2溶液浸種對酸脅迫下多花黑麥草幼苗超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性的影響Fig．3 Influences of CoCl2on activities of SOD and POD of seedings of Lolium multiflorumunder acid stress

圖4 CoCl2溶液浸種對酸脅迫下多花黑麥草幼苗超氧陰離子產生速率和過氧化氫含量的影響Fig．4 Influences of CoCl2on production rate of O－2·and H2O2content of seedings of Lolium multiflorumunder acid stress

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