利用菊芋一步法生產酒精工程菌構建的研究

李雪雁，張 維，張秀蘭，李 冰

（蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州730050）

菊芋（Helianthus tuberosus）是菊科向日葵屬中能形成地下塊莖的栽培種，其塊莖中菊粉含量可占其干質量的70%以上，且這種植物適應性強，產量高，價格低廉，是一種寶貴的半野生資源，具有極大的開發利用價值。菊芋是酒精發酵的良好糖源，近年來，有關利用微生物菊粉酶進行菊芋酒精發酵的報道［1］相繼出現，但選育高產酒精菌種直接應用于生產仍是人們努力的方向。余響華等［2］以K氏酵母、糖化酵母為親本，采用單親滅活原生質體融合技術進行屬間融合，構建可直接轉化淀粉產酒精的菌株。結果獲得高于92%的形成率和6．5%的再生率，最終獲得一株性狀穩定、酒精轉化率高的融合子，在含5．0%的可溶性淀粉發酵液中，酒精度可達7．0%。本研究通過設定合適的原生質體制備與融合條件，使釀酒酵母［3］與一種能高產菊粉酶的青霉菌菌株進行原生質體融合，通過測定融合菌株的產菊粉酶能力和產酒精能力，選用各項性能較優的融合子作為利用菊芋進行酒精發酵的菌株，旨為生物質可再生資源轉化生產燃料酒精提供理論依據和研究資料。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌種 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為蘭州理工大學生命學院微生物實驗室保存；青霉菌（Penicillium）為本試驗前期工作中篩選所得產菊粉酶的菌株。

1．1．2 培養基

酵母YPD培養基：蛋白胨10g·L－1，葡萄糖20g·L－1，酵母膏10g·L－1。

青霉菌培養基：菊粉40g·L－1，酵母膏5 g·L－1，（NH4）2HPO410g·L－1。

再生培養基：將15%蔗糖（溶透穩定劑）加入YPD培養基，成分參見酵母YPD培養基。

融合子酒精發酵培養基：菊粉90g·L－1，酵母膏5g·L－1，蛋白胨10g·L－1。

1．1．3 試劑 Na2HPO4、檸檬酸、蔗糖、EDTA、β－巰基乙醇、PEG、CaCl2、蝸牛酶、纖維素酶、酒石酸鉀鈉、醋酸鈉、冰醋酸和果糖，試驗所涉及藥品均為分析純。

1．2 方法

1．2．1 菌種活化與擴大培養 試驗中，由于釀酒酵母和青霉菌冷藏了一段時間，故需對其活化1～2代。方法為在試管斜面培養基上，28～30℃培養48 h，然后轉接入液體搖瓶中（裝量為100mL／500mL三角瓶），28～30℃，200r·min－1振蕩培養。

1．2．2 原生質體制備

酵母菌原生質體制備

1）離心洗滌、收集細胞：分別取5mL上述培養至對數生長期的酵母細胞培養液，3 000r·min－1離心10min，棄上清液，向沉淀的菌體中加入5mL緩沖液，用無菌接種環，攪散菌體，振蕩均勻后離心洗滌1次，再用5mL高滲緩沖液離心洗滌1次，收集菌體。

2）酶解脫壁：向收集的菌體中加入3mL脫壁預處理劑，振蕩均勻，于30℃保溫30min，離心5～10min，棄上清，無菌水洗滌2次。所用脫壁酶為1．5%蝸牛酶，30 ℃，150r·min－1輕微振蕩，每隔30min取樣鏡檢酶解程度，處理1～2h即可停止酶解處理，加入10%蔗糖溶液低滲沖擊，然后離心5～10min，棄酶液，收集原生質體及未酶解細胞［4－6］。用高滲溶液洗滌，懸浮于原生質體保存液。

青霉菌原生質體制備：用無菌接種環從靜置液體培養的三角瓶中挑出菌膜（對數生長期內），置于無菌的圓底離心管中，用4mL，加入3mL脫壁預處理劑，稍微振蕩，于30℃保溫30min，離心5～10 min，棄上清，用4mL，去上清液，加入2%纖維素酶和1%蝸牛酶混合酶液共3mL，同時加入0．1mL 10%β－巰基乙醇，于30℃水浴酶解3h，間或搖動。酶解結束后，2 500r·min－1離心5min，棄酶液，收集原生質體及未酶解細胞［7－8］。

1．2．3 原生質體再生 將原生質體稀釋適當倍數后涂于再生高滲培養基平板，28℃培養，3～5d后觀察。

1．2．4 原生質體融合 取兩親本原生質體各1mL，混合于滅菌小試管中，2 500r·min－1離心10min，棄上清液，向上述沉淀菌體中加入2mL促溶劑，輕輕搖勻，32℃水浴保溫30min，取適量，適當稀釋后涂布于完全培養基固體平板上，28℃培養3～5d后觀察。

1．2．5 融合子的性能測定 挑取原生質體融合后在以菊粉為唯一碳源的培養基平板上長出的若干大菌落接種，30℃培養24～48h，后轉接于液體完全培養基中。利用其營養標記、酶活力的測定、融合子的酒精發酵特性、細胞形態、體積大小、繁殖速率、發酵強度等方面的觀察和測定結果來鑒定融合子。

1）融合子菊粉酶活力測定：菊粉酶的活力分為內切酶活力（I）和外切酶活力（S），具體測定方法見參考文獻［9］。

2）酒精濃度測定：取100mL成熟發酵液到蒸餾瓶中，加入100mL水，混勻后蒸餾。取餾出液100mL。用酒精比重計測定餾出液中的酒精濃度［10］，再校正為20℃時的酒精濃度。

3）糖分利用率與酒精的實際出率的計算參考文獻［11］。

2 結果

2．1 原生質體制備條件的選擇

2．1．1 菌齡 原生質體的形成與菌齡有很大關系，本試驗選取對數生長期的酵母細胞培養液，培養時間控制在12h以內。絲狀真菌生長較慢，18h以后肉眼才能看見菌膜，因此，菌齡控制在24h內，以更好地形成原生質體。

2．1．2 脫壁條件的選擇 酵母原生質體制備一般選用蝸牛酶作為脫壁酶，本試驗所采用的蝸牛酶濃度為1．5%，酶解時間1～2h。絲狀真菌類原生質體制備一般選用蝸牛酶，纖維素酶不同濃度的組合酶系，本試驗選擇2%纖維素酶加1%蝸牛酶的混合酶液，絲狀真菌所需脫壁時間較長，酶解時間約3h，究其原因可能是菌膜沒有被搗碎，酶與菌絲體接觸面積小，不利于原生質體的釋放。

2．2 原生質體的融合及融合子的檢出 采用PEG（MW 6000）促融法，將兩親本等比例混合，PEG濃度為30%，32℃水浴保溫30min。

原生質體融合的兩個親本，其一為可以產生菊粉酶的青霉菌，其二為可以進行酒精發酵的酵母菌，二者融合以后直接采取選擇性培養基鑒定的方法可很容易檢出真正的融合子，挑取原生質體融合后長出的若干大菌落接種在以菊粉為唯一碳源的培養基平板上，30℃培養24～48h。后轉接于液體完全培養基中，其融合子的酒精發酵特性、酶活力測定、細胞形態、體積大小、繁殖速率等方面的觀察和測定結果表明，均不同于雙親菌株，因此，可確定為融合子。

2．3 酒精發酵菌株R8菌落形態 R8菌株在平板上的菌落形態更接近于酵母菌，只是菌落透明度并不高，同時沒有表現出很明顯的青霉菌菌落的形態（圖1）。

2．4 融合子性能測定及篩選 通過對初步確定的16株融合菌株的進一步性能測定，包括其產菊粉酶的能力、產酒精的能力以及遺傳穩定性的研究，最終確定一株利用菊芋發酵產生酒精的菌株。

圖1 R8菌株平板菌落形態Fig．1 Morphology of R8strains flat colony

2．4．1 產菊粉酶能力測定 融合菌株R1、R3、R4、R8、R14產菊粉酶活力均極顯著高于其他各組（P＜0．01）（圖2）。為了能從中篩選出產酒精能力強的發酵菌種，本研究將產菊粉酶活力相對較好的融合菌株R1、R3、R4、R10、R11、R14，在進一步的產酒精能力試驗中都作為考察對象。

2．4．2 產酒精能力的測定 菌株R3和R8的產酒精能力均極顯著高于其他各組（P＜0．01），而且酒精得率均為41．16%（圖3），這可能是因為菌株R3的酒精耐受性比R8好，R8的產酶能力隨發酵液中酒精濃度的增加而受到抑制。但考慮到R8產菊粉酶活力高于R3，基本確定R8作為后續酒精發酵的菌株。測定誤差，進行數據描述和分析。

圖2 R1－R16菊粉酶活力測定結果Fig．2 Inulinase activity determination results of R1－R16

圖3 融合菌株酒精發酵得率測定Fig．3 Alcohol fermentation rate determination of fusion strains

2．4．3 融合子穩定性測定結果 融合子R8穩定性測定結果表明，四代以內，酒精得率不變，均為41．16%，內切酶與外切酶活力有所波動，均為無規律小范圍波動，穩定性相對良好（表1）。最終選擇融合菌株R8作為進行后續發酵的菌株。

3 結論

選用適合釀酒酵母和青霉菌的不同原生質體制備條件，經融合與鑒定，篩選出了16株融合子，分別對其產菊粉酶和產酒精能力及其三代以上遺傳穩定性做了測定，最終確定最優菌株為R8，內切酶活力為8．97U·mL－1，外切酶活力為25．09U·mL－1，酒精得率為41．16%，原料糖分利用率為75．52%，穩定性良好。

表1 融合子R8穩定性測定結果Table 1 Stability of fusion R8

利用原生質體融合技術構建出一種可以直接利用菊芋為原料來發酵產生酒精的菌種，經過初步的性能測定，篩選出一種產菊粉酶和產酒精能力較優的菌株，為進一步提高菊芋酒精發酵的產量有一定的參考意義。

［1］ 李俊俊，唐艷斌，唐湘華．復合酶在菊芋粉發酵生產燃料乙醇中的應用［J］．釀酒科技，2009（3）：65－68．

［2］ 余響華，張華山，李亞芳．原生質體融合構建直接轉化淀粉生產燃料酒精的新型菌株［J］．釀酒科技，2006（5）：25－28．

［3］ 李高揚，李建龍，王艷，等．利用高產牧草柳枝稷生產清潔生物質能源的研究進展［J］．草業科學，2008，25（5）：15－21．

［4］ 彭幫柱，岳田利，袁亞宏．酵母菌與原生質體融合技術［J］．西北農業學報，2004，13（1）：101－103．

［5］ 李英軍，馬曉燕．馬克斯克魯維酵母原生質體制備和再生條件的研究［J］．釀酒科技，2006（7）：51－54．

［6］ 俞志敏，欒靜，徐鵬．耐高糖釀酒酵母原生質體制備與再生過程研究［J］．釀酒科技，2008（4）：45－48．

［7］ 甘志波，趙學慧．黑曲霉AMS－11原生質體的制備［J］．湖北農業科學，1994（3）：32－34．

［8］ 王燕．雙親滅活米曲霉原生質體融合中原生質體制備的研究［J］．中國釀造，2007（5）：19－22．

［9］ 王靜，金征宇．黑曲霉產菊粉酶的發酵條件優化及誘變育種［J］．生物技術，2002，12（3）：42－45．

［10］ 秦耀宗．酒精工藝學［M］．北京：中國輕工業出版社，1998：317－326．

［11］ 諸葛健，王正祥．工業微生物實驗技術手冊［M］．北京：中國輕工業出版社，1994：97－99．