BCL-2家族在缺血性腦血管病中的抗凋亡作用

杜圓圓1綜述，羅永杰2△審校

(1.瀘州醫學院，四川瀘州646000;2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院神經內科，四川成都610072)

BCL-2家族在缺血性腦血管病中的抗凋亡作用

杜圓圓1綜述，羅永杰2△審校

(1.瀘州醫學院，四川瀘州646000;2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院神經內科，四川成都610072)

目前由于腦缺血的高發病率、高死亡率，許多學者對其進行深入研究，發現腦缺血后神經損傷中除壞死外，還存在神經元凋亡現象。細胞凋亡是由基因調控的細胞主動死亡過程，神經元死亡分為兩個階段，其第二階段為遲發性死亡(delayed neuronal death，DND)，即在腦缺血中，神經細胞在再灌注后數小時甚至數天后才發生死亡。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡過程中具有重要的調控作用，其抗凋亡蛋白成員和促凋亡蛋白成員之間的協同作用，共同決定細胞是否進入凋亡程序。其表達的變化對細胞的命運起決定作用。

腦缺血;BCL-2家族;凋亡

1 Bcl-2家族蛋白質的一般特性

1.1 Bcl-2家族成員及其分類Bcl-2家族分為三個亞族:原生存亞族(pro-survival subfamily)即Bcl-2亞族，成員有Bcl-2、Bcl-Xl、KS-Bel-2、Bcl-w、Mcl-1、BHRF1、NR-13、ORFl6、LMW5-HL、AI、EIB-19K及CED-9;兩個原凋亡亞族(proapoptotic subfamily)是Bax和BH3亞族。Bax、Bak及Bok屬于Bax亞族，Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Bim、Bad、Bid及EGL-l屬BH3亞族［4］。其中15種蛋白為哺乳動物(主要是人)所有，NR-13為雞類所有，線蟲C.elegans中的蛋白有CED-9及EGL-l，病毒蛋白有LMW5-HL、BHRFl、ORF-16、KS-Bcl-2和EIB-19K。

1.2 Bcl-2相關蛋白結構Bcl-2基因是B細胞淋巴瘤/白血病-2的縮寫，Tsujimoto等［5］于1984年從濾泡性淋巴瘤和白血病細胞中分離出來的一種原癌基因。正常情況下，Bcl-2基因位于18q21，含有3個外顯子和2個開放閱讀框架(啟動子)。第一個外顯子不翻譯，蛋白編碼區為外顯子2、3。基因組DNA的外顯子2被一個＞50 kb的內含子隔成兩部分，轉錄時這一內含子序列被剪切掉。Bcl-2基因轉錄6.0 kb的mRNA，經不同拼接，翻譯為由239個氨基酸殘基組成、分子量為26kd的Bcl-2a和21kd的Bcl-2B兩種相似的蛋白。其結構特點是在梭基端有一個由19個疏水氨基酸組成的疏水性片段，能使Bcl-2蛋白插入膜結構中，并有多個高度保守功能片段:S-N，SⅡ/SⅡ-C，BH1和BH2。免疫組化及共聚焦顯微鏡、激光掃描顯微鏡和電子顯微鏡觀察發現，Bcl-2蛋白位于核膜、粗面內質網和線粒體膜上［6～8］。Bcl-2基因是一種強有力的細胞死亡抑制因子，其成員在細胞凋亡中的作用分為兩類:一類為抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等;另一類為促凋亡蛋白，包括Bax、Bak、Bid等。Bcl-2家系的成員均由1-4個Bcl-2同源區域(Bcl-2 homology domain，BH)構成，BH1-BH4均具有α螺旋結構。到目前為止，發現所有抗凋亡因子均具有BH1到BH4 4個同源區域，而促凋亡因子均缺乏第一個α螺旋片段—BH4區域［9，10］。BH3區域對于促凋亡因子來說似乎是最重要的功能區，因為目前已經發現促凋亡因子Bid、Bad和Bim等只有BH3區。另外，許多Bcl-2成員羧基端存在一個疏水區域(carboxy-terminal hydrophobic，TM)，它決定了Bcl-2家族蛋白的生物膜靶向性［11］。家族各成員之間可以形成同源或異源二聚體，抗凋亡蛋白成員和促凋亡蛋白成員之間的協同作用，共同決定細胞是否進人凋亡程序。

1.3 Bcl-2的生物功能Bcl-2基因在許多胚胎組織中廣泛表達［12］，但在成體組織中，Bcl-2似乎在迅速分裂并分化的細胞中表達，這類細胞包括腸上皮或皮膚隱窩的干細胞以及造血祖細胞。在成熟的細胞或處于將被消除的階段的細胞中，bcl-2的表達下降。例如在角質化細胞或髓細胞分化過程以及在B和T細胞分化過程中，當這些細胞即將通過凋亡而發生克隆性消亡時，Bc1-2均下調。有人據此假設Bcl-2是早期始祖細胞或長壽命的已充分分化的細胞的存活因子。另一方面，在組織分化過程中。Bcl-2的下調似乎促進在克隆選擇期間發生的或者與上皮或造血細胞的終未分化相關的細胞死亡。Bcl-2蛋白的生理功能主要是抑制細胞凋亡，延長細胞壽命，而不影響細胞周期和分化進程，這對于維持體內某些需長期生存的細胞如神經元、免疫記憶細胞、造血干細胞等的壽命具有重要意義［13］。

2 Bcl-2抗凋亡作用機理

Bcl-2蛋白定位于線粒體膜、內質網膜和核膜上，具有離子通道和停靠蛋白的雙重功能，它在介導細胞凋亡的途徑中起關鍵作用。線粒體在細胞凋亡過程中發揮非常重要的作用，Bcl-2蛋白在線粒體膜上從三個方面抑制細胞凋亡:①Bcl-2能改變線粒體巰基的氧化還原狀態來控制其膜電位從而調控細胞凋亡。在細胞凋亡中，線粒體的巰基可能組成了胞內氧化還原電位的傳感器，Bcl-2可能是通過抑制谷胱甘肽(GSH)的外泄，降低胞內的氧化還原電位，來抑制細胞凋亡的;②Bcl-2能調節線粒體膜對一些凋亡蛋白前體的通透性。Bcl-2蛋白可能是線粒體PT孔道的組成成分，它在較高pH的條件下能形成離子通道，而Bax則能在較為廣泛的pH范圍內形成孔道。Bax能允許一些離子和小分子如細胞色素c等穿過線粒體膜，進入細胞質，從而引起細胞凋亡，而Bcl-2的作用正好相反，它能封閉Bax形成孔道的活性，使一些小分子不能自由通透，從而保護細胞凋亡;最新研究認為，細胞質存在誘導轉錄因子，可介導細胞質基因表達來調節細胞的生存［14］。③bcl-2能將凋亡蛋白前體Apaf-1等定位至線粒體膜上，使其不能發揮凋亡作用。實驗證明，盡管Bcl-2與胱冬肽酶之間無親和力存在，但當二者在細胞中同時表達時卻發現它們之間有相互作用。這種作用可能是間接的，是通過第三者CED-4來實現的。Bcl-2能與線蟲中的CED-4結合并抑制其功能，而Apaf-1具有與胱冬肽酶結合的功能域，能參與細胞色素c依賴的胱冬肽酶激活。這表明Apaf-1就象線蟲中CED-4一樣，一方面能激活胱冬肽酶引起凋亡;另一方面又作為接頭蛋白能把Bcl-2相關蛋白與胱冬肽酶聚集在一起，并使胱冬肽酶失活，從而保護細胞凋亡［15］。其次，Bcl-2蛋白在內質網上也發揮著重要作用，通過調控內質網Ca2+參與的核內外物質轉運及膜通透性轉換(PT)來阻止細胞色素C從線粒體中釋放，達到阻止細胞凋亡的級聯反應過程［16、17］，從而阻斷細胞凋亡。

3 腦缺血后Bcl-2家族的表達及意義

缺血性腦血管病的發病機制包括能量耗竭、酸中毒、興奮性氨基酸毒性作用，細胞內鈣超載、氧自由基、炎癥細胞因子介入、細胞凋亡等多個方面［18］。腦缺血程度決定細胞死亡方式，嚴重缺血引起細胞能量耗竭，細胞內鈉、鈣升高導致細胞壞死，輕微缺血及再灌注損傷則易觸發凋亡［18］。腦缺血后，神經元壞死與凋亡并存，細胞壞死位于缺血中心區，細胞凋亡主要出現在缺血周邊區;而在腦缺血的遲發性神經元死亡期，則以細胞凋亡為主。凋亡可能決定了最終梗死體積。研究表明，Bcl-2基因是腦缺血神經元凋亡調控基因的重要組成部分。Bcl-2的過度表達能明顯抑制缺氧所介導的神經元死亡［19］，其參與神經細胞的分化發育調節，并且可以促進視神經節細胞軸突的生長和再生。通過基因敲除、轉基因動物和基因轉染等實驗發現，具有明顯的抑制細胞凋亡作用和神經保護作用。shimazaki等［20］研究短暫性缺血后沙土鼠海馬中Bcl-2蛋白表達發現，在缺血2分鐘后，海馬CAI區Bcl-2蛋白的免疫反應活性增加，誘導了對繼發性缺血的耐受性，并阻止了遲發性神經元死亡;然而缺血5分鐘，Bcl-2蛋白免疫反應活性下降，在海馬CAI區可出現神經元死亡。但是，先用缺血2分鐘處理后恢復血流，再繼發缺血5分鐘，則可阻止第2次缺血后遲發性神經元死亡，從而認為短暫性缺血后海馬CAI區獲得的對遲發性神經元死亡的抑制與Bcl-2蛋白有密切的關系。Chen等［21］對大鼠缺血60 min及120 min后再灌流24小時Bcl-2表達進行了觀察，結果發現缺血60 min組在大腦皮層可有Bcl-2蛋白表達，缺血120 min組，可發現小膠質細胞，內皮細胞和血管壁均有表達，這說明腦缺血中沒有受到致命損傷細胞可誘導Bcl-2表達。而Bcl-2只表達在肯定能存活的神經元上。Bcl-2表達的上調也許反映了一種保護神經元積極生存的機制。

在研究Bcl-2蛋白及其作用機制時，發現一種相對分子質量為21 000的蛋白，命名為Bax;bax基因5'非翻譯區有4個p53結合位點，編碼區含有Bcl-2蛋白高度同源的BHI和BHZ結構域，是bax自身和Bcl-2家族其他成員形成同型或異型二聚體，促進細胞凋亡［22］。Krajewski等［23］在全腦缺血再灌流模型著重觀察了bax蛋白變化。他們發現全腦缺血10 min后再灌流0.5～3小時時，各腦區神經細胞逐漸呈變性改變，bax免疫染色明顯增強。利用雙標法同步分析bax蛋白和原位DNA片段在缺血細胞中的變化，發現進行凋亡的神經元bax蛋白免疫呈高表達，主要存在于海馬CA1區及小腦purkinje細胞。他們也發現變性神經元Bcl-2免疫反應下降，尤其是Bcl-x，因此他們認為Bcl-2家族某些基因決定DND的發生。Sermadias等［24］認為Bax不僅能和Bcl-2形成二聚體抑制凋亡，而且其自身還能形成二聚體誘導凋亡，Bax蛋白過度表達時bax同源二聚體增多，對誘導凋亡的刺激因素更加敏感。bax有對抗hcl-2，促進凋亡的功能。并有研究發現細胞內這兩種蛋白之間的動態關系可以用Bcl-2/Bax比率來表示，而Bcl-2/Bax比率的高與低可能決定細胞在受到凋亡刺激信號后是趨向于存活或死亡，即Bcl-2/Bax＞1時，對細胞凋亡起抑制作用，細胞趨于存活;Bcl-2/Bax＜1時，對細胞凋亡起促進作用，細胞趨于死亡［25～27］。

4 展望

細胞凋亡是缺血性腦損傷中細胞死亡的途徑之一，而Bcl-2家族蛋白在其不同成員相互協同作用下，發揮抗凋亡或促凋亡作用。在腦缺血損傷早期采用轉基因、HSV載體或其他新的病毒載體、以及神經保護劑如IL-8單克隆抗體［28］等積極的方法，增加Bcl-2等抗凋亡基因的表達，有可能成為今后臨床治療缺血性腦血管病的一個新方法。此外，Bcl-2基因在某些情況下并不能阻止細胞凋亡，如不能阻止腫瘤壞死因子(TNF)等介導的細胞凋亡，這也揭示細胞凋亡的復雜的分子機制，還需進一步研究。

［1］宋休云，胡金鳳，陳乃宏.神經細胞凋亡腦缺血疾病［J］.中國藥理學通報，2012，28(3):307-310.

［2］Dell AE，Chen Y，Engidawork E，et al.Delayed neuronal death following perinatal asphxia in rat［J］.Exp Brain Res，1997，115:105-115.

［3］Martin LJ.Neuronal cell death in nervous system development，disease，and injury［J］.Int J Mol Med，2001，7(5):455.

［4］Zhang R，Xue YY，Lu SD，et al.Bcl-2 enhances neurogenesis and inhibits apoptosis of newborn neurons in adult rat brain following a transient middle cerebral artery occlusion［J］.Neurobio Dis，2006，24(2):345-356.

［5］Pulera MR，Adams LM，Lin H，et al.Apoptosis in a neonatal rat model of cerebral hypoxia-ischemia［J］.Stroke，1998，29:2622-2630.

［6］Binienda Z.A fetal rat model of acute Perinatal ischemic-hypoxia［J］.Ann N Y Acad Sci，1995，72(1):28-38.

［7］Zhong LY，Sarafian T，Kane DJ，et al.Bcl-2 inhibits death of central neural cells induced by multiple agents［J］.Proc Natl Cad Sci USA，1993，90(10):4533-4537.

［8］Vaux DL.Toward an understanding of the molecular mechanisms of Physiological cell death［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90(3):786-789.

［9］Gross A，Mc Donnell JM，Korsmeyer SJ.Bcl-2 family members and the mitochondria in apoptosis［J］.Genes Dev，1999，13:1899-1911.

［10］Burlacu A.Regulation of apoptosis by Bcl-2 family proteins［J］.J CellMol Med，2003，7:249-225.

［11］Nguyen M，Millar DG，Yong VW，et al.Targeting of Bcl-2 to the mitochondrial outer membrane by a COOH-terminal signal anchor sequence［J］.J Biol Chem，1993，268:25265-25268.

［12］吳靜，路紅，薛群基.Bcl-2基因的研究進展［J］.世界華人消化雜志，2004，12(9):2171-2173.

［13］王彤，劉存志，劉玉珍，等.bcl-2/bax基因調控機體細胞凋亡的機制研究進展［J］.中國老年學雜志，2008，28(12)1658-1660.

［14］Brivanolu AH，Darnell JEJ.Signal t ransduct ion an d the control of gene expression［J］.Science，2002，295:813-818.

［15］Reed JC.Bcl-2 family proteins and mitochondria［J］.Biochim Biophys A cta，1998，1366(1-2):127-137.

［16］Lam M，Dubyak G，Chen L，et al.Evidence that BCL-2 represses apoptosis by regulating endoplasmic reticulum-associated Ca2+fluxes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91(14):6569-6573.

［17］Baffy G，Miyashita T，Reed JC，et al.Apoptosis induced by withdrawal of interleukin-3(IL-3)from an IL-3-dependent hematopoietic cell line is associated with repartitioning of intracellular calcium andisblocked by enforced BCL-2 oncoprotein production［J］.J Biol Chem，1993，268(9):6511-6519.

［18］范剛剛，馮建華，羅永杰.低氧誘導因子1及熱休克蛋白70對缺血性腦血管病的保護機制［J］.實用醫院臨床雜志，2011，8(4):101-102.

［19］刁慧芳，趙敏，趙曉霞，等.高血壓大鼠腦缺血再灌注后IGF-I Bcl-2的表達與細胞凋亡［J］.山西醫藥雜志，2008，37(3):124-126.

［20］Hale AJ，Smith CA，Sutherland LC，et al.Apoptosis:molecular regulation of cell death［J］.Eur J Biochem，1996，236:1-26.

［21］Shimazaki K，Isliida A，Kawai N，et al.Increase in bcl-2 on-coprotein and the tolerance to ischemia induced neuronal death in the gerbil hippocampus［J］.Neurosei Res，1994，20:95-99.

［22］Zhang LT，Sarafian T，Kane DJ，et al.Bcl-2 inhibits death of central neural cell induce by multiple agents［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90:4533.

［23］Jurgensmeier JM，Xie Z，Deveraux Q，et al.Bax directly induces release of cytochrome c from isolated mitochondria［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95:4997-5002.

［24］Krajewski S，Mai JK，Krajewska M，et al.U pregulation of bax protein levels in neurons following cerebral ischemia［J］.J Neurosci，1995，15:63-64.

［25］Willis SN，Fletcher JI，Kaufmann T，et al.Apoptosis initiatedwhen BH3 ligands engagemultiple Bcl-2 homologs，not Bax or Bak［J］.Science，2007，315(5813):856-859.

［26］Pepper C，Hoy T，Bentley DP.Bcl-2/Bax ratios in chronic lymphocytic leukaemia and their correlation with in vitro apoptosis and clincal resistance［J］.Br J Cancer，1997，76(7):935-938.

［27］Isenmann S，Stoll G，Schroeter M，et al.Differerntial regulation of Bax，Bcl-2，and Bcl-X proteins in focal cortial ischemia in the rat［J］.Brain Patho，1998，8(1):49-62.

［28］Schabitz WR，Sommer C，Zoder W，et al Intravenous brain-derived neurotrophic factor reduces infarct size and counter regulates Bax and Bcl-2 expression after temporay focal cerebral ischemia［J］.Stroke，2000，31:2212-2127.

［29］劉楠，韓英，陳榮華，等.IL-8單克隆抗體對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用［J］.中華神經科雜志，2005，38(4):535-538.

Anti-apoptotic effects of BCL-2 family in ischemic cerebrovascular disease

DU Yuan-yuan，LUO Yong-jie

R743.31;R329.25

B

1672-6170(2012)05-0219-04

2012-04-21;

2012-05-21)

△通訊作者，碩士生導師