經典Wnt信號通路對成骨細胞增殖和分化的影響*

唐 泉 孫元明

骨的重建由骨的生成和吸收構成，成骨細胞具有骨的形成功能，破骨細胞具有骨吸收作用。兩者之間的動態平衡是維持正常骨量的關鍵。成骨細胞來源于骨髓間充質干細胞，在骨形成過程中要經歷成骨細胞增殖、細胞外基質成熟、細胞外基質礦化和成骨細胞凋亡4個階段。其中任何一個階段出現異常時，都會對骨量和骨的組成產生重要的影響。

Wnt蛋白家族為一類高度保守的蛋白家族，其與一系列的生物過程，如胚胎發育、器官生成及腫瘤形成等有關[2]。Wnt蛋白在成骨細胞中可以通過經典Wnt信號通路調節成骨細胞的增殖和分化，參與骨發生過程的調節。經典Wnt信號通路的活性降低時，會產生骨組織的畸變[3]。經典Wnt通路中各種成分如低密度脂蛋白受體相關蛋白LRP5、β-catenin等也均分別可以對成骨細胞的發育過程產生影響，還可能導致骨質疏松癥或者骨質減少等疾病[4]，現已成為研究成骨細胞代謝的重要靶點[5]。本文對其在成骨細胞的調節中所起的作用進行綜述。

1 經典Wnt信號通路

Wnt家族由19種高度保守的富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白組成[6]，大小為39～46 ku。Wnt通路的命名來源于其家族中前兩個成員：小鼠中的int和果蠅中的wingless。所有的Wnt蛋白含有23～24個半胱氨酸殘基，大部分氨基酸殘基可以形成分子內二硫鍵并進行轉錄后修飾。Wnt蛋白與由Frizzled（FZD）、G蛋白偶聯受體（G-protein coupled receptor，GPCR）和低密度脂蛋白受體相關蛋白（low density lipoprotein recep?tor-related protein，LRP）構成的膜受體復合物結合。這種結合可以激活兩條信號通路：經典Wnt信號通路（Wnt/β-catenin信號通路）和非經典Wnt信號通路（Wnt/Ca2+信號通路等）[7]。調節骨形成的信號通路主要是LRP5/6的下游信號通路[8]。經典Wnt信號通路主要通過調節轉錄輔助激活因子β-catenin的數量發揮作用[9]。

經典Wnt信號通路對于成骨細胞的影響首次發現于其對人類骨質疏松癥-假神經膠質瘤（osteoporosis physiology，OPPG[10]）綜合征和由LRP5基因突變導致的高骨量（high bo?nemass，HBM[10]）表型的研究中。通過LRP5突變的基因敲除和轉基因小鼠模型可以弄清楚經典Wnt信號通路如何控制骨的形成。

對β-catenin在細胞和亞細胞中位置的調節是經典信號通路影響細胞功能的核心[11]。當Wnt通路未被激活時，β-catenin水平維持在一個穩定的水平。部分β-catenin被多蛋白復合體磷酸化[12]，該復合體包括：蛋白激酶1（casein ki?nase 1，CK1）、糖原合酶激酶（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）及支架蛋白等。然后β-catenin被定向泛素化進而通過蛋白酶體機制降解[13]。當Wnt通路被激活后，Wnt蛋白首先與細胞表面受體復合物（由LRP5和人卷曲蛋白Fzd構成，Fzd是一種跨膜蛋白）結合[14]，然后LRP5被GSK-3β雙磷酸化，這一作用將體軸發育抑制因子Axin募集到膜上，復合物與Axin結合，使得細胞表面受體復合物與CSK-3β分離，該過程的具體機制還不清楚，可能是因為LRP5與Axin的結合是一種競爭性的對GSK-3β結合蛋白的活化。CSK-3β可以通過磷酸化β-catenin起到對其抑制的作用。抑制GSK-3β對β-catenin的磷酸化作用是經典Wnt信號通路中重要的一步[15]。GSK-3β與其結合蛋白結合，失去磷酸化β-catenin的功能。沒有被GSK-3β磷酸化的β-catenin在細胞內積累到一定程度后，將對細胞核內基因的表達產生一定影響。淋巴細胞增強子結合因子LEF（lymphoid enhancer binding factor）和T細胞因子TCF（T-cell factor）是β-catenin在細胞核內最典型的作用因子。β-catenin替代輔阻遏物（co-repressor，CoR）直接與LEF/TCF結合并互相作用，并且募集輔助轉錄激活因子刺激許多基因的表達，包括原癌基因c-myc和細胞周期蛋白D等。

2 經典Wnt信號通路對成骨細胞的影響

經典Wnt信號通路對骨髓間充質干細胞分化為骨組織的脂肪細胞和軟骨細胞方面的研究已有報道，其對成骨細胞的調節也有一定的研究。經典Wnt信號通路可以從增殖和分化水平上對成骨細胞進行調節。

經典Wnt信號通路的激活可以增加成骨細胞的增殖[16]。LRP5基因雙缺失的小鼠體內成骨細胞的增殖減少，而LRP5（G171V）的轉基因小鼠體內成骨細胞的數量顯著增加，而且顱骨中凋亡的成骨細胞和軟骨細胞的數量也減少。Wnt10b基因在間質細胞中的過表達在體內會使骨密度增加，小梁骨的數量和厚度也都增加，在體外可以促進成骨細胞的發生過程[17]。在成年小鼠體內，Wnt拮抗物（分泌型卷曲相關蛋白Sfrp1、異藻藍蛋白Apc、抑癌蛋白Dkk）的表達鈍化或減少可以顯著增加小梁骨的骨量。

Wnt信號通路對成骨細胞分化的各個時期都具有調節作用。Wnt蛋白可以刺激成骨細胞分化過程中的一些早期事件并促進前體細胞的生長。在C3H10T1/2、C2C12、ST2細胞系中，一些Wnt蛋白（Wnt3a）可以誘導堿性磷酸酶（ALP）的活性，這是成骨細胞分化早期過程中的重要事件。盡管Wnt3a可以引起ALP活性的顯著改變，但是成骨細胞的其他標記如Runx2、骨鈣素、I型膠原卻不受Wnt分子的影響。在成骨細胞分化階段，Wnt信號通路中的一些關鍵成分的表達會受到調控。Wnt信號通路的拮抗劑，如Sfrp2、Dkk1、FrzB，在成骨細胞分化的后期表達量都明顯增多，表明一種對Wnt的負反饋調節可能控制成骨細胞成熟的最后階段。其次LRP5缺失小鼠表現出骨質沉積減少。成骨細胞內β-catenin過表達時，膠原I型a1和a2的表達量也增加。

2.1 Wnt受體LRP5對成骨細胞的影響 LRP5屬于低密度脂蛋白受體相關蛋白家族，是一種跨膜蛋白，編碼1 615個氨基酸。細胞外結構主要有N末端6xYWTD重復序列和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）樣序列構成，這種結構重復4次，末端連接1個低密度脂蛋白（low-density lipopro?tein receptor，LDLR）樣的配體結合區，能夠通過受體介導的胞吞作用與配體結合。

成骨細胞中Wnt信號通路重要性的發現表明Wnt受體LRP5的激活可以導致骨量增高，失活則可以導致骨質疏松癥。對若干受到OPPG影響的家族和OPPG患者進行研究，發現LRP5缺失的突變個體會產生OPPG[10]。OPPG是一種罕見的可導致骨骼失衡和眼睛紊亂的常染色體隱性遺傳疾病，是由于LRP5基因的功能缺失導致的。OPPG患者的主要癥狀是骨量很低，而且有產生骨骼斷裂和變形的傾向。對使LRP5的功能增加的突變基因進行研究表明，LRP5功能增加的突變體的骨密度增加，具有HBM的特性[18]。對這些重要的發現在小鼠模型中得到進一步的確認，對小鼠進行LRP5基因敲除和引入功能增加突變會產生與OPPG和HBM相同的表型。對LRP5基因敲除小鼠模型的培養表明缺少LRP5基因時，成骨細胞的數量和增殖率會減少，而對成骨細胞的凋亡無影響[19]。缺失LRP5對成骨細胞的凋亡和分化無影響，同樣LRP5的缺失對成骨細胞的發生和骨吸收也無影響。這表明LRP5的缺失會減少小鼠的骨量是由于骨細胞的增殖和活性降低造成的。相反，對LRP5功能增強的小鼠模型LRP5G171進行研究，發現小鼠體內骨量和骨強度增加，ALP活性增加，成骨細胞的凋亡減少，但細胞的活性、數量和骨吸收量無改變[5]。這說明高骨量小鼠骨組成增加是由于成骨細胞的凋亡減少成骨細胞的數量增加引起的。

2.2 β-catenin對成骨細胞的影響 β-catenin是一種與細胞黏附有關的細胞內分子，通過與E-鈣黏著蛋白和α-catenin相互作用影響黏附作用。通過Wnt經典通路，β-catenin在細胞質中穩定和積累，然后進入細胞核與LEF/TCF轉錄因子結合以調節Wnt通路的靶基因。在成年人體內，β-catenin的缺失可以減少成骨細胞的數量，增加破骨細胞的數量[20]，從而影響骨的生理功能。

β-catenin在骨的發生中具有多種作用。在α1（Ⅱ）-colla?gen-Wnt14轉基因小鼠中軟骨細胞中的異位Wnt信號通路使軟骨細胞成骨增強并且抑制軟骨生成。相反，在α1（Ⅱ）-col?lagen-Cre轉基因小鼠中，β-catenin失活，能夠導致異位的軟骨形成和成骨細胞的分化。這說明由β-catenin介導的Wnt信號通路對成骨細胞的分化具有重要的抑制作用。但是在小鼠已分化的成骨細胞中β-catenin的缺失不會產生LRP5缺失時產生的那種表型和分子水平的異常，這種突變主要通過影響成骨細胞中骨保護素（osteoprotegerin，OPG）的形成，進而增加破骨細胞的數量，影響骨的吸收[21]。

2.3 糖原合酶激酶3（GSK-3）β GSK-3是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，對細胞內的多個過程都具有調控作用[22]。在哺乳動物中有兩種亞型，α型（51 ku）和β型（47 ku）[23]。在Wnt信號通路的細胞內影響因子中，最有可能成為藥物靶點的便是GSK-3β。GSK-3β有2個特性：一是其在細胞中一般是有活性的，主要是通過抑制其活性對其進行調節。二是它能夠優先結合已被其他激酶磷酸化的亞基。

GSK-3β抑制劑可以誘導成骨細胞的分化和骨的組成，增加骨量和骨強度。在一些小鼠模型中使用GSK-3β抑制劑（如LiCl等）[11]時，骨形成會加強，骨量會增加。鋰能夠緩解LRP雙基因缺失的小鼠體內骨質減少的現象，并且可以達到與野生型骨質水平基本一致的效果。鋰作用于野生型小鼠時，會增加其骨量。在切除卵巢的大鼠體內給予GSK-3β抑制劑，網狀的皮質骨的礦化含量和骨礦物質密度（bone miner?al density，BMD）顯著提高。這些都表明鋰或者其他抑制劑劑對GSK-3β的修飾可能會具有治療骨質減少的作用。

3 結論

骨的重建過程是骨的動態本質[24]，與骨的形成過程相同，也是通過破骨細胞的吸收和成骨細胞的形成相互平衡來確保骨重建過程的正常進行。經典Wnt信號通路可以調節成骨細胞，并且對其在成骨細胞內的作用過程，即組成通路的成分有了一個大概的了解，對經典Wnt信號通路如何影響成骨細胞的增殖和分化雖然有了基礎的認識，但是隨著對信號通路的深入探索，發現與此通路相關的成分越來越多，很多問題還有待解決。

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