FHIT基因在膀胱移行細胞癌中的表達及意義

張春霆 劉冉錄 林英立 徐 勇

膀胱癌是最常見的泌尿系腫瘤，其中移行細胞癌（transitional cell carcinoma，TCC）占90%。膀胱癌的發生、發展可能是一種牽涉到多種抑癌基因的失活和致癌基因激活的復雜過程。本文旨在研究脆性組氨酸三聯體（fragile histidine triad，FHIT）基因與膀胱移行細胞癌之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2007年9月—2011年3月我院泌尿外科預存組織新鮮標本，病理證實為膀胱移行細胞癌62例，其中男46例，女16例，年齡29～78歲，平均（56.5±7.5）歲。腫瘤分期按UICC-TNM標準，分為表淺性腫瘤（Tis～T1組）39例，浸潤性腫瘤（T2～T4組）23例。病理分級按WHO方案：Ⅰ級37例，Ⅱ～Ⅲ級25例。同時獲取部分患者癌旁正常膀胱組織35例。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 采用UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒（MBI產品，購自上海生物工程技術服務有限公司）。

1.2.2 FHIT基因引物 檢索基因庫查詢FHIT基因的cDNA序列（U20770），用Primer 6引物設計軟件設計引物序列如下：上游5′-TGA GGA CAT GTC GTT CAG ATT G-3′，下游5′-GTG TCA CTG AAA GTA GAC C-3′，引物擴增片段462 bp（合成于日本TaKaRa寶生物工程大連有限公司）。β-actin引物（合成于北京大學醫學部分子生物學實驗室），上游5′-GAA TTC ATG TTT GAG ACC TTC AA-3′，下 游 5′-CC GGA TCC ATC TCT TGC TCG AAG TCC A-3′，擴增片段326 bp。DNA Marker為PRB322DNA/AIU1Marke（rMBI產品，購自上海生工生物工程技術服務有限公司）。

1.2.3 cDNA合成 按MMLV第1鏈cDNA合成試劑盒說明進行。PCR擴增：PCR反應體系配制前，將FHIT基因引物配制成100 μmol/L的溶液，工作液再稀釋4倍。加入β-actin上下游引物溶液作為內參照采用同管擴增，0.5 mL PCR薄壁管加入以下成分：ddH2O 14.8 μL；10×buffer 3 μL；dNTP 3 μL；MgCl21.8 μL；cDNA 5 μL；FHIT上下游引物各0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.4 μL；β-actin上下游引物各0.5 μL，反應體系終體積為30 μL，放入PCR儀中反應，條件如下：94 ℃ 30 s，57 ℃40 s，72℃ 30 s，共30個循環后，72℃延伸5 min，補平PCR產物的延伸末端進行PCR反應，完畢后，取反應產物8 μL加入溴芬蘭2 μL，在15 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳，電壓5 V/cm。電泳結果在凝膠成像系統中應用Gene Tools及Gene Snaps軟件系統照相可見正常組織電泳帶FHIT基因表達擴增產物大小為462 bp，β-actin擴增片段大小為362 bp，見圖1。

Figure 1 Electrophoresis of PCR-amplified FHIT gene expression in normal tissues圖1 正常組織中FHIT基因表達擴增電泳

1.3 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析，樣本率的比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

膀胱移行細胞癌中的FHIT基因缺失表達率高于正常膀胱組織，Ⅱ～Ⅲ級的FHIT基因缺失表達率高于Ⅰ級，T2～T4期的FHIT基因缺失表達率高于Tis～T1期，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01），見表1。

Table 1 Expression of FHIT gene between normal bladder tissue and transitional cell bladder carcinoma表1 正常膀胱組織和膀胱移行細胞癌中FHIT基因的表達情況 例（%）

3 討論

FHIT基因是腫瘤抑制基因，包含了脆性位點FRA3B68，該脆性位點部位與染色體重排過程中斷裂位點關系密切，研究顯示在所有與腫瘤相關的染色體轉位中，超過52%的轉位斷裂位點與脆性區域相關[1]。FHIT基因定位于染色體3P 14.2。Ohta等[2]利用定位克隆技術及外顯子捕獲法發現該基因由10個外顯子組成，其中5～9個編碼外顯子，其蛋白質結構與三價組氨酸域HIT蛋白高度同源（>50%），該基因跨越人類染色體脆性位點FRA3B。FHIT基因存在于多種正常組織中，但其異常表達與胃癌[3]、喉癌[4]、食管癌[5]、乳腺癌[6]及小細胞肺癌[7-8]有關。

本研究結果顯示FHIT基因在癌旁正常膀胱組織中缺失率（2.86%）低于在膀胱移行細胞癌組織（58.06%），表明FHIT基因異常表達與膀胱移行細胞癌發生有關，FHIT基因異常在膀胱移行細胞癌中可能是一頻發事件；在膀胱移行細胞癌中，隨著病理分期及臨床分期的進展，FHIT表達率下降，表明FHIT基因的喪失表達可能參與了膀胱癌的發展，這一結果與大多研究FHIT基因在腫瘤中的表達狀況類似。

Abraham等[9]對膀胱癌的染色體檢測發現，FHIT基因異常促進了膀胱癌的進展。Baffa等[10]利用RT-PCR對6例膀胱癌起源的細胞和3例原發性膀胱癌的FHIT基因轉錄本的完整性進行檢查，發現6個細胞株中有3個（50%）無野生型FHIT轉錄表達；4個細胞株中未測到Fhit蛋白，表明FHIT基因異常與膀胱癌發生有關。

FHIT基因作為一個新的腫瘤抑制基因，異常表達于多種腫瘤組織來源的細胞系中，若要了解FHIT基因在膀胱移行細胞癌中抑制腫瘤作用的分子機制，尚需進一步深入研究。

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