標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在山羊育種中的應(yīng)用

肖玉萍，周 磊，程勝利，楊保平，魏云霞

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050）

我國山羊絨年產(chǎn)量已達(dá)1萬t左右，貿(mào)易量占全球的50%以上，但山羊個體的生產(chǎn)水平較低，并且在傳統(tǒng)的選擇模式下，山羊經(jīng)濟(jì)性狀的選擇進(jìn)展也很慢。而標(biāo)記輔助育種能充分利用表型、系譜和遺傳標(biāo)記的信息，與只利用表型和系譜信息的常規(guī)選種方法相比，具有更大的信息量，且可允許進(jìn)行早期選種、縮短世代間隔、提高選擇的準(zhǔn)確性和選擇強(qiáng)度、降低育種成本，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)選擇技術(shù)準(zhǔn)確率低、育種周期長的缺點(diǎn)，從而加快山羊的育種進(jìn)程。近年來，隨著標(biāo)記輔助選擇方法的逐步完善和許多影響山羊重要經(jīng)濟(jì)性狀的QTL的成功定位，標(biāo)記輔助選擇在未來山羊育種改良中將會發(fā)揮越來越重要的作用［1］。

1 標(biāo)記輔助選擇在動物育種應(yīng)用中的基本策略

1.1 標(biāo)記輔助選擇

標(biāo)記輔助選擇（marker assisted selection，MAS）是通過尋找對動物特定性狀有較大影響的數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait loci，QTL）附近的分子標(biāo)記，并通過判斷標(biāo)記的基因型對種畜進(jìn)行選擇的方法。MAS育種的基本技術(shù)路線:尋找包含QTL的染色體片段，在這些區(qū)域內(nèi)標(biāo)定相應(yīng)QTL的位置，并找到與該QTL緊密連鎖的遺傳標(biāo)記，確定與性狀變異有關(guān)的特定基因及其功能位點(diǎn)，在遺傳標(biāo)記的輔助下較準(zhǔn)確地對特定性狀進(jìn)行選擇。MAS應(yīng)用于動物育種時主要有以下3種方法：

①在常規(guī)動物模型的基礎(chǔ)上加上分子標(biāo)記的信息，即同時利用表型、系譜和分子標(biāo)記的信息進(jìn)行個體育種值估計。個體育種值可以分為兩部分，QTL育種值與多基因育種值。有研究者將僅用標(biāo)記信息輔助選擇的效率同BLUP選種和根據(jù)標(biāo)記+表型最佳組合選種作比較，其結(jié)論為只有當(dāng)標(biāo)記基因與QTL間的連鎖緊密時標(biāo)記輔助選擇才會有效。若對標(biāo)記效應(yīng)估計不準(zhǔn)確，則標(biāo)記效率就會降低。②兩階段選擇。在生產(chǎn)性能測定之前根據(jù)分子標(biāo)記信息進(jìn)行選擇，將攜帶有理想分子標(biāo)記等位基因的個體選留下來參加性能測定，用常規(guī)方法BLUP進(jìn)行育種值估計，并進(jìn)行第2次選擇，從而提高選擇差和選擇強(qiáng)度。③早期選擇。由于分子標(biāo)記的一個重要優(yōu)點(diǎn)是其測定不受年齡的限制，因此，當(dāng)對某個性狀所掌握的QTL能夠保證進(jìn)行早期選擇（根據(jù)標(biāo)記信息），并產(chǎn)生更大的遺傳進(jìn)展和育種效益時，可以考慮采用早期選擇。

控制某一數(shù)量性狀的基因是多位點(diǎn)的，只有那些對相應(yīng)經(jīng)濟(jì)性狀具有適當(dāng)或有足夠大效應(yīng)的QTL才可用于MAS。QTL對相應(yīng)性狀的效應(yīng)，可用該QTL純合子間性狀差異的一半來衡量。在MAS中，一般要求其效應(yīng)值a至少為0.5個標(biāo)準(zhǔn)差。Saefudin（1991）指出，某QTL的效應(yīng)值a越大，則該QTL在MAS中被選擇來利用所需的代數(shù)就越少。Smith（1986）認(rèn)為，具有適當(dāng)效應(yīng)值和中間程度基因頻率（0.1

另外，標(biāo)記輔助選擇是以遺傳標(biāo)記與QTL連鎖為基礎(chǔ)的，所以標(biāo)記與QTL間的連鎖程度是決定MAS的關(guān)鍵。遺傳標(biāo)記與QTL的連鎖程度可用重組率、連鎖不平衡值和標(biāo)記與QTL間的圖距厘摩等來衡量。由于重組等原因，常使遺傳標(biāo)記與QTL的連鎖信息不能跨家系或跨群體使用。在對同一群體的連代選擇中，由于重組，其連鎖水平也將會隨代數(shù)增加而逐漸下降，從而造成運(yùn)用標(biāo)記選擇的能力逐代降低。因此，采用那些與QTL緊密連鎖的標(biāo)記是促進(jìn)標(biāo)記輔助選擇廣泛應(yīng)用的有力手段。

1.2 標(biāo)記輔助導(dǎo)入

任何一個品種不可能帶有全部優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀的基因，但若能鑒定出若干個有較高經(jīng)濟(jì)價值的等位基因，通過有效的雜交育種將其擴(kuò)散到全群將大大提高整體的生產(chǎn)水平。如果某個品系除了1個或幾個等位基因外，其他各方面性能都較差，此時可使用標(biāo)記輔助導(dǎo)入方法（Marker-assisted introgression，MAI）導(dǎo)入優(yōu)良的基因。

在基因?qū)霑r，有2種方式可利用遺傳標(biāo)記：①利用遺傳標(biāo)記對欲導(dǎo)入的基因進(jìn)行標(biāo)記；②利用遺傳標(biāo)記來選擇或排除某一特定的背景基因型。基因?qū)霑r采用如下途徑：利用帶有被導(dǎo)入等位基因（或數(shù)量性狀主基因）的群體與受體群進(jìn)行多代回交，繼而進(jìn)行橫交使目的基因純合。標(biāo)記輔助導(dǎo)入方案的效率取決于終端群體被導(dǎo)入基因的頻率和有益經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳進(jìn)展（Haley C S.，1991）。Hospital（1992）認(rèn)為，使用標(biāo)記比不使用標(biāo)記重新獲得基因組的效率快2個世代。

動物育種一般具有較長的世代間隔、較低的繁殖力和較高的飼養(yǎng)成本。因此，一般只針對那些效應(yīng)較大的基因進(jìn)行標(biāo)記輔助導(dǎo)入。如Hanset等（1995）采用與RYR座位緊密連鎖的標(biāo)記進(jìn)行前景選擇，將抗應(yīng)激敏感的基因成功地導(dǎo)入到皮特蘭豬中。

2 影響標(biāo)記輔助選擇效率的因素

總結(jié)諸多關(guān)于標(biāo)記輔助選擇相對效率的研究，標(biāo)記輔助選擇的效率總體上高于常規(guī)選擇方法，但標(biāo)記輔助選擇的優(yōu)勢究竟有多大，不同研究者的結(jié)果差別很大。影響因素主要有:①所選性狀的遺傳特性。一般認(rèn)為用標(biāo)記輔助選擇低遺傳力性狀、限性性狀和抗病性狀的效率較高；而高遺傳力性狀和早期表達(dá)的性狀，標(biāo)記輔助選擇的效率則較低［2-4］。盡管如此，也有學(xué)者認(rèn)為，并非性狀的遺傳力越低，標(biāo)記輔助選擇的效率越高。因為當(dāng)某一性狀的遺傳力很低時，標(biāo)記與QTL的連鎖效應(yīng)以及標(biāo)記被檢出的機(jī)率都會受到影響，從而也就降低了標(biāo)記輔助選擇的選擇反應(yīng)。Moreau L 等［5］、Hospital F 等［6］研究指出，當(dāng)遺傳力低于0.2時，標(biāo)記輔助選擇的選擇反應(yīng)會變得不穩(wěn)定，需要重復(fù)估計，標(biāo)記輔助選擇對中等遺傳力性狀（h2=0.2～0.4）最為適用。②標(biāo)記與QTL的連鎖程度。標(biāo)記與目的基因或QTL連鎖得越緊密，標(biāo)記輔助選擇的效率越高［5，7-8］。Meuwissent等［9］通過對奶牛的研究發(fā)現(xiàn)，祖父的遺傳標(biāo)記可以說明孫女預(yù)測值家系內(nèi)方差的13.3%，但該數(shù)值會隨著側(cè)翼標(biāo)記距離的增大而降低。③QTL的數(shù)目和效應(yīng)。當(dāng)控制某一數(shù)量性狀的QTL數(shù)目較多、效應(yīng)較大時，標(biāo)記輔助選擇往往能取得明顯的效果，當(dāng)QTL的效應(yīng)小到一定程度時，用其來進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇就變得沒有意義。但Moreau L等［5］研究認(rèn)為，某數(shù)量性狀的QTL數(shù)目較多時，QTL間就有可能存在一定的連鎖，這不僅會增加計算的復(fù)雜性，而且易引起檢出“幻影”QTL，以至于影響標(biāo)記輔助選擇的效率。④QTL參數(shù)估計的準(zhǔn)確性。QTL參數(shù)估計的準(zhǔn)確性是影響標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的最關(guān)鍵因素之一，過高或過低估計QTL的效應(yīng)都會降低標(biāo)記輔助選擇的效率。Spelman等［10］的研究表明，如果在育種程序中通過標(biāo)記輔助選擇利用了虛假的QTL，不僅不會提高選擇效果，反而會降低遺傳進(jìn)展。如果QTL參數(shù)估計的結(jié)果不可靠，甚至是錯誤的，那么在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的標(biāo)記輔助選擇就是不可靠之上的不可靠，就是一錯再錯、錯上加錯了。⑤其他因素。除了上述因素會影響標(biāo)記輔助選擇的效率外，QTL有利基因的起始頻率和其他影響常規(guī)方法選擇效果的因素如育種方案、群體的規(guī)模和結(jié)構(gòu)，以及選擇的世代數(shù)等也會影響標(biāo)記輔助選擇的效率。許多研究［5，8，11］結(jié)果表明，群體規(guī)模是影響標(biāo)記輔助選擇效率的一個重要因素，多數(shù)情況下標(biāo)記輔助選擇的相對效率會隨著群體規(guī)模的增大而提高。也有不少研究表明，標(biāo)記輔助選擇所獲得的額外選擇反應(yīng)（相對于常規(guī)選擇而言）在短期選擇時較大，而在長期選擇時卻會因連鎖不平衡降低等原因而下降［11］。但如果能在選擇過程中不斷地檢測到新的QTL，當(dāng)“老”QTL趨于固定時將其加入選擇指數(shù)中，則可能繼續(xù)保持標(biāo)記輔助選擇在選擇效率上的優(yōu)勢。

3 標(biāo)記輔助選擇在山羊育種中的應(yīng)用

沈偉等［1］以遼寧絨山羊、柴達(dá)木絨山羊和柴達(dá)木山羊3個群體共147只山羊為研究對象，運(yùn)用PAGE和RAPD技術(shù)對山羊的體重、絨產(chǎn)量和絨細(xì)度3個性狀進(jìn)行了與標(biāo)記基因關(guān)系的遺傳分析，結(jié)果表明：EsD222型、LAPBB型和PA322型分別為體重、絨產(chǎn)量和絨細(xì)度性狀的優(yōu)勢標(biāo)記基因型；可利用標(biāo)記輔助預(yù)測的方法充分利用多基因座標(biāo)記基因間的互作效應(yīng)；在體重上，尋找到有顯著選擇效應(yīng)的RAPD條帶11個，在絨產(chǎn)量和絨細(xì)度上分別為9個和6個；在多目標(biāo)性狀選擇中，CY0818/AO型和OPW 19/C1型為體重和絨產(chǎn)量的雙重優(yōu)勢RAPD標(biāo)記，CY0818/G1型為體重和絨細(xì)度的雙重優(yōu)勢RAPD標(biāo)記。張亞妮等采用PCR-SSCP技術(shù)研究了絨山羊KAP基因的多態(tài)性，并通過標(biāo)記位點(diǎn)與經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳相關(guān)預(yù)測了選擇反應(yīng)。其結(jié)論為：在產(chǎn)絨量性狀上，S1-AB，S1-BB，S3-BB和S4-AB基因型可以作為標(biāo)記基因型；在體重性狀上，S3-AA和S3-AB基因型可以作為標(biāo)記基因型；在體重和產(chǎn)絨量性狀上，S2-BB基因型可作為多性狀標(biāo)記輔助選擇的標(biāo)記。馬蕊霞［12］采用PCRSSCP和基因測序技術(shù)，對140只隴東白絨山羊和130只中衛(wèi)山羊的KAP6.1和KAP S.1基因部分序列進(jìn)行了多態(tài)性分析，并通過經(jīng)濟(jì)性狀與多態(tài)位點(diǎn)的遺傳相關(guān)計算了各位點(diǎn)的選擇反應(yīng)以確定經(jīng)濟(jì)性狀的優(yōu)勢標(biāo)記位點(diǎn)，結(jié)果：篩選了6位點(diǎn)，只在4個位點(diǎn)得到了特異性擴(kuò)增結(jié)果表明，檢測 L1、L2、L3、L4四個位點(diǎn)存在多態(tài)性，且均為3個基因型AA、AB和BB型；中衛(wèi)山羊在L1、L2、L3三個位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，在L4位點(diǎn)不平衡。隴東白絨山羊只有在L3位點(diǎn)是平衡的，在L1、L2、L4三個位點(diǎn)的分布均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)。結(jié)合基因型的選擇，L1位點(diǎn)的BB基因型可以作為隴東白絨山羊體重性狀和產(chǎn)絨量性狀的首選標(biāo)記基因型；L3位點(diǎn)的AB基因型可以作為中衛(wèi)山羊體重性狀和產(chǎn)絨量性狀的首選標(biāo)記基因型。耿社民等［13］通過對127只遼寧絨山羊血液蛋白質(zhì)座位與經(jīng)濟(jì)性狀遺傳關(guān)系的分析結(jié)果表明:PA-32－2型在產(chǎn)絨量和體重兩方面的LSE都顯著的大于其他基因型，而且PA-3座位的選擇反應(yīng)最大，可以作為多性狀標(biāo)記輔助選擇時的標(biāo)記基因型；其次TfAB型、ESDBB型可作為產(chǎn)絨量的標(biāo)記基因型，LAPAB作為體重的標(biāo)記基因型。于輝等［14］采用PCR-SSCP、PCR-RFLP和DNA測序等技術(shù)，檢測了內(nèi)蒙古白絨山羊、陜北白絨山羊兩個絨山羊品種共計1 006個個體的角蛋白相關(guān)蛋白基因（KAP7.1、KAP9.2、KAP16.2和KAP16.6）和同源異型盒基因（Hoxc13）等8個基因座的遺傳變異，分析了其遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多態(tài)性。同時運(yùn)用SPSS（16.0）軟件，利用最小二乘擬合線性模型等方法對內(nèi)蒙古白絨山羊在上述基因座中的多態(tài)性與產(chǎn)絨性狀及體重進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，得出：Hoxc13基因包含2個外顯子在內(nèi)的3個基因座中未檢測出多態(tài)性；KAP9.2P1和KAP9.2P2基因座在陜北白絨山羊和內(nèi)蒙古絨山羊群體中均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)；陜北白絨山羊在KAP16.2基因座中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，而內(nèi)蒙古白絨山羊群體在該基因座中處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)。陜北白絨山羊和內(nèi)蒙古白絨山羊群體在KAP16.6基因HindⅢ酶切位點(diǎn)中處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)，而在KAP16.6基因E－co130Ⅰ酶切位點(diǎn)中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。趙苗等［15］以內(nèi)蒙古白絨山羊、陜北白絨山羊兩個絨山羊品種共計1 006個個體為材料，利用PCR-SSCP、aPCRSSCP、PCR-RFLP、生物信息學(xué)、DNA測序和DNA序列分析技術(shù)，研究了KAP基因家族中的4個HGT-KAP基因（KAP6.1、KAP6.2、KAP8.1、KAP8.2 基因的全 CDS 區(qū)）、MTNR1a基因（外顯子2）、SS基因（全CDS區(qū)）共6個候選基因8個基因座的遺傳變異，同時探討絨山羊群體遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多態(tài)性及其與經(jīng)濟(jì)性狀（產(chǎn)絨量、毛長、絨厚、抓絨后體重、產(chǎn)羔數(shù)、初生重）的關(guān)系，同時初步探討了PCR-SSCP和aPCR-SSCP兩種方法的優(yōu)點(diǎn)與不足。結(jié)果表明：在陜北絨山羊和內(nèi)蒙古絨山羊群體中，KAP6.1基因和KAP8.2基因為單態(tài)，KAP6.2基因中共揭示了2個SNP和1個缺失突變；KAP6.2基因的片段僅在陜北絨山羊群體中存在，并且處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，而在內(nèi)蒙古絨山羊群體中并沒有檢測到。不同多態(tài)基因座與內(nèi)蒙古絨山羊產(chǎn)絨性狀和抓絨后體重的方差分析表明，KAP6.2基因?qū)Ρ驹囼炈鶛z測的性狀沒有影響，KAP8.1基因的不同基因型對毛長性狀有極顯著影響(P＜0.01），因此該試驗將KAP8.1基因作為毛長性狀的候選基因；MTNR1a基因外顯子2中的SNP對產(chǎn)絨性狀和抓絨后體重沒有影響。但是，MTNR1a-4-577基因座對內(nèi)蒙古絨山羊的產(chǎn)羔數(shù)有影響顯著，MTNR1a-4-589基因座對羔羊初生重有顯著影響，故將MTNR1a-4-577作為產(chǎn)羔數(shù)選擇的標(biāo)記，而MTNR1a-4-589基因座可以作為初生重選擇的標(biāo)記；利用PCR-SSCP的方法并沒有檢測到SS基因突變基因座的存在。Gootwine等［16］借助與FecB座位緊密連鎖的兩個微衛(wèi)星標(biāo)記OarAE101和BM1329對FecB進(jìn)行前景選擇，將Booroola羊中的FecB基因利用標(biāo)記信息輔助導(dǎo)入到了Awassi乳用綿羊中，這是標(biāo)記輔助導(dǎo)入FecB基因來培育高繁殖力綿羊的一個重要成果。

4 結(jié)語

標(biāo)記輔助選擇由于充分利用了遺傳標(biāo)記、表型和系譜的信息，因此具有比常規(guī)遺傳評定方法更大的信息量，可提高個體遺傳評定的準(zhǔn)確性。同時由于標(biāo)記輔助選擇不易受環(huán)境的影響，且沒有性別、年齡的限制，因而允許進(jìn)行早期選種，可縮短世代間隔，提高選擇強(qiáng)度，從而提高選種的效率和準(zhǔn)確性，因此在山羊的遺傳改良中具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，我們應(yīng)清醒地認(rèn)識到，分子標(biāo)記技術(shù)只是起輔助作用，輔助選擇離不開常規(guī)育種。憑借分子標(biāo)記輔助選擇手段育成品系或品種的報道在山羊育種中還相對較少，通過分子標(biāo)記輔助選擇提高育種效率，大規(guī)模培育優(yōu)良品種的期望仍未實現(xiàn)。從已有的研究結(jié)果來看，標(biāo)記輔助選擇的真正應(yīng)用尚有很多需要研究解決的問題，未來的成功還需要不斷積累新的經(jīng)驗和知識。隨著國際綿羊和山羊基因組計劃的深入開展和完成，許多影響山羊重要經(jīng)濟(jì)性狀的QTL已經(jīng)或正在被成功定位，人們對標(biāo)記輔助選擇的研究也將不斷深入，標(biāo)記輔助選擇也將從理論研究逐漸進(jìn)入實際應(yīng)用階段，標(biāo)記輔助選擇也必將在未來的山羊育種改良中發(fā)揮出其應(yīng)有的作用。

［1］沈偉,李蘭,潘慶杰,等.山羊經(jīng)濟(jì)性狀標(biāo)記輔助選擇的遺傳效應(yīng)分析［J］.遺傳，2004，26（5）:625-630.

［2］Lande R,Thompson R.Efficiency of marker-assisted selection in the improvement of quantitative traits［J］.Genetics,1990,124:743-756.

［3］Meuwissen T H E,Goddard M E.Theuse of marker-haplo types in animal breedingschemes［J］.Genet Sel Evol,1996,28:161-176.

［4］Ruane J,Coleau J J.Marker-assisted selection for rasex limited character in anucleus breeding population［J］.J Dairy Sci,1996,79:1666-1678.

［5］Moreau L，CharcossetA，HospitalF，etal.Markerassisted selectionefficiency in populations of finitesize［J］.Genetics,1998,148:1353-1365.

［6］Hospital F,Moreau L,Lacoudre F.More on the efficiency of marker-as sisted selection［J］.Theor Appl Genet,1997,95:1181-1189.

［7］Edwards M D,Page N J.Evaluation of marker-assisted selection through computer simulation［J］.Theor Appl Genet,1994,88:376-382.

［8］Gimelfarb A,Lande R.Marker-assisted selection and marker-QTL as sociations in hybrid populations［J］.Theor Appl Genet,1995,91:522-528.

［9］Meuwissen T H E,Van Arendonk J A M.Potential improvements in rate of genetic gain from marker-assisted selection in dairy cattle breeding schemes［J］.J Dairy Sci,1992,75:1651-1659.

［10］Spelman R J,Van Arendonk J A M.Effect of in accurate parameter estimates on genetic respon set marker-assisted selection in an outbred population［J］.J Dairy Sci,1997,80:3399-3410.

［11］Zhang W,Smith C.Computer simulation of marker-assisted selection nutilizing linkage disequilibrium［J］.Theor Appl Genet,1992,83:813-820.

［12］馬蕊霞.兩個山羊品種KAP基因遺傳多樣性分析及其與部分經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)研究［D］.陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

［13］耿社民,常洪,秦國慶,等.絨山羊結(jié)構(gòu)基因標(biāo)記座位與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)系的研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2003,34（1）:24-27.

［14］于輝，王昕，陳宏.絨山羊KAP9.2基因多態(tài)性研究［C］//全國養(yǎng)羊生產(chǎn)與學(xué)術(shù)研討會議論文集.蘭州：中國草食動物雜志社，2008.

［15］趙苗，陳宏，王昕，等.兩個絨山羊品種KAP6.2基因的突變研究［C］//全國養(yǎng)羊生產(chǎn)與學(xué)術(shù)研討會議論文集.蘭州：中國草食動物雜志社，2008.

［16］Gootwine E,Yossefi S,Zenou A,et al.Marker assisted selection for FecB carriers in Booroola Awassi crosses［C］//Proc 6th World Congr Genet Appl Livest Prod,Armidale,Australia,1998:161-164.