環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶特性研究及來源菌株的篩選改造

楊顏慈

西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069

0 引言

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（Cyclodextrin glycosyltransferase, CGTase）是一種水解酶，它既可以催化分子內(nèi)部的也可以催化分子間的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，如環(huán)化、連接、不同葡萄糖數(shù)目的寡糖化[1]。CGTase 的主要功能是催化淀粉、糖原、麥芽寡聚糖等葡萄糖聚合物合成環(huán)糊精（Cyclomaltodextrin ,CD）。根據(jù)環(huán)鏈的葡萄糖殘基數(shù)目的不同，CD 可分為α-、β-、γ-環(huán)糊精等。由于環(huán)糊精在食品、化妝品、醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)、生物轉(zhuǎn)換及紡織業(yè)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，這使得催化環(huán)糊精形成的CGTases日益得到了人們的重視。

1 環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)組成及其功能

除了來自克雷白氏桿菌的CGTases，其他的 CGTases 均有 5個(gè)可識(shí)別的域（A-E）[2]。A 域有 2 部分，A1 和 A2，分別位于氨基酸序列的第1-138和 203-406 位(來源于Bacillus circulans 251 的 CGT 酶)[2]。A 域包含 8 個(gè) α-螺旋和 8 條平行的 β-折疊，具有催化性，因此也稱為 (β/α)8桶狀催化域[3]。B 域（139-202）是在 A 域的第三個(gè)β-折疊后面所延伸的一個(gè)環(huán)區(qū)域[2]。來自域 A/B 的+2 到-7 處的亞位點(diǎn)是催化位點(diǎn)[2]。Rimphanitcha- yakit 等[4]指出 C 域和 D 域?qū)γ富钚杂袕?qiáng)烈的影響作用，其功能可能是影響 E 域在酶上的正確定位。E 域則保證了 CGTase 的穩(wěn)定性和完整性[5]。

2 環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)物專一性機(jī)理

人們研究認(rèn)為各種CGT酶一級(jí)結(jié)構(gòu)的不同引起了酶的產(chǎn)物特異性。通過分析α-、β-、γ-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)前兩種酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)很相近，但γ型則與前兩種類型的酶在以及結(jié)構(gòu)中有較大的差異[6]。Rimphanitchayakit等[4]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出，對(duì)酶產(chǎn)物專一性有重要影響的氨基酸區(qū)域從碳端算起在功能域A和B區(qū)域的中部。Boris等[7]研究認(rèn)為亞位點(diǎn)6,7,8是酶特異性的關(guān)鍵位點(diǎn)，對(duì)這些亞位點(diǎn)的氨基酸序列進(jìn)行突變實(shí)驗(yàn)，會(huì)引起酶產(chǎn)物專一性的變化。

3 環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的催化反應(yīng)類型

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶能催化淀粉和其他相關(guān)的碳水化合物經(jīng)分子內(nèi)的糖基轉(zhuǎn)移作用環(huán)化合成環(huán)糊精，即環(huán)化反應(yīng)；該酶還能通過分子間的糖基轉(zhuǎn)移作用催化偶合反應(yīng)和歧化反應(yīng)；再者，環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶還具有較弱的催化淀粉水解的能力，即水解反應(yīng)。

環(huán)化作用是CGTase的特有反應(yīng)，α-（1-4）葡聚糖分子通過分子內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成CD。該反應(yīng)受SDS、Triton等界面活性劑影響，所生成的CD種類，要由界面活性劑的疏水性基的大小而定[8]。表面活性劑對(duì)α-CGT酶生產(chǎn)的促進(jìn)作用可能是由大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)外膜滲透性增加所致，使細(xì)胞周質(zhì)空間中α-CGT酶能更加快速地滲透到胞外[9]。

4 影響環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶特性及產(chǎn)物的一些因素

不同來源的CGTase 會(huì)有不同的反應(yīng)活性、最適反應(yīng)條件及主要產(chǎn)物，但一些酶的最適反應(yīng)條件范圍較窄且具有不穩(wěn)定性或其主要產(chǎn)物不是人們需求的，所以人們希望通過對(duì)酶的一些修飾改造達(dá)到擴(kuò)大最適反應(yīng)條件范圍，增加酶活力、穩(wěn)定性及目標(biāo)產(chǎn)物量的目的。

4.1 不同化學(xué)修飾對(duì)酶活性的影響

曹新志等[10]用焦碳酸二乙酯、N-溴代琥珀酰亞胺和碳化二亞胺修飾后，酶活力大幅度下降，說明組氨酸、色氨酸和羧基氨基酸為酶活力所必需。

4.2 氨基酸殘基突變對(duì)酶熱穩(wěn)定性的影響

傅毅等[11]研究發(fā)現(xiàn)氨基酸殘基經(jīng)過突變后含有了更多的帶電殘基，突變型的酶中鹽橋數(shù)量增加了10%。氨基酸殘基的突變使蛋白質(zhì)的總能量降低，外周的離子鍵和疏水性增強(qiáng)，使得酶的耐熱性增加。

4.3 一些化學(xué)物質(zhì)對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

鄭賢良等[12]篩選出了可以提高重組 α-CGT 酶熱穩(wěn)定性及貯存穩(wěn)定性的四種穩(wěn)定劑：明膠、甘油、PEG400、CaCl2。將上述4種穩(wěn)定劑按一定濃度組合成復(fù)合穩(wěn)定劑，其穩(wěn)定效果可明顯提升。

5 產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株的篩選及改造

可作為CGTase生產(chǎn)者的大多數(shù)微生物來自桿菌類；厭氧分支桿菌、克雷白氏桿菌、超嗜熱古菌、嗜熱產(chǎn)氣桿菌及嗜高溫菌也是該酶的來源菌種[2]。

5.1 產(chǎn)α-環(huán)糊精為主的菌株

Gawande等[13]發(fā)現(xiàn)了一種可以產(chǎn)CGTase的菌株——Klebsiella pneumoniae AS-22。此菌株產(chǎn)的CGTase的最適反應(yīng)溫度為35℃～50℃，最適pH為6～9。當(dāng)以糊化淀粉和小麥淀粉為底物時(shí)，該酶的產(chǎn)物包括α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精及γ-環(huán)糊精，其比例是81:12:7。

5.2 產(chǎn)β-環(huán)糊精為主的菌株

王雁萍等[14]采用氯離子注入法對(duì)一株被鑒定為嗜堿芽孢桿菌的菌株進(jìn)行誘變，得到了產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的高產(chǎn)菌株，其酶活力達(dá)到6 000U/mL。該菌株產(chǎn)生目標(biāo)酶的最適溫度為28℃，pH為9。

5.3 產(chǎn)γ-環(huán)糊精為主的菌株

嗜堿的Bacillus sp.290-3、Bacillus sp.AL-6和類芽孢桿菌Brevibacterium sp.No.9605是到目前為止僅有產(chǎn)生γ-CD CGTase的菌株[15]。

5.4 將產(chǎn)酶基因轉(zhuǎn)入常見菌種進(jìn)行生產(chǎn)

成成等[16]將來源于軟化類芽孢桿菌的α-CGTase 基因插入質(zhì)粒，并將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌，得到重組菌E. coli BL21/ pET-cgt。該方法得到的α-CGTase的胞外比活比來源菌所產(chǎn)天然酶的比活提高了42倍。

6 展望

人們對(duì)CGTase的研究已有百年歷史，特別是近二十年,環(huán)糊精利用范圍的增加使 CGTase的研究成為了熱點(diǎn)，人們對(duì)這類酶的結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理及一些來源菌株已經(jīng)有了較深的認(rèn)識(shí)，但也有許多問題人們還未研究清楚，如CGTase產(chǎn)物專一性的機(jī)理，結(jié)構(gòu)域D的功能等。相信隨著科學(xué)技術(shù)手段的發(fā)展及人們對(duì)菌株改造手段的提升, CGTase的結(jié)構(gòu)與功能將會(huì)明晰,其產(chǎn)物的專一性機(jī)理及增大生產(chǎn)實(shí)踐中單一產(chǎn)物的生產(chǎn)量問題也會(huì)得到解決，對(duì)該酶的透徹研究必將促進(jìn)其在各方面的應(yīng)用，為人類帶來巨大效益。

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