馬來酸桂哌齊特對腦缺血后炎癥反應、軸突蛋白的表達及神經功能的影響

黃艷玲，張 敏，賀 曦

（重慶市急救醫療中心神經內科 400014）

白細胞介素（interleukin，IL）是主要由單個核細胞（包括淋巴細胞和單核－巨噬細胞）產生的一組免疫活性因子，作用于淋巴細胞、巨噬細胞和其他細胞，共同參與機體免疫反應、應激反應及炎癥的調節。研究發現，IL在腦缺血后表達明顯增加，產生神經毒性，介導腦缺血后炎性反應，參與缺血性腦損傷。本研究擬觀察馬來酸桂哌齊特（cinepazide maleate，CM）對大鼠腦缺血／再灌注后腦組織炎癥反應、神經絲蛋白－200（NF－200）的表達及對神經功能的影響，更深入地探討CM對缺血性腦損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組 成年雄性SD大鼠48只，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級，體質量250～280g。造模前適應性喂養1周。隨機分為正常組、假手術組、缺血／再灌注2d組、缺血／再灌注7d組、CM治療2d組和CM治療7d組，每組8只。

1.1.2 實驗藥品與用法 CM由北京四環生物制藥有限公司生產，規格為每支80mg。于再灌注后按3.0mg／kg進行稀釋，立即從尾靜脈注射，每日1次。

1.2 方法

1.2.1 大腦中動脈閉塞 （MCAO）模型的制作 術前12h禁食。參照 Longa等［1］及 Nagasawa和 Kogure［2］的線栓法:用3.5%水合氯醛（1mL／100g，腹腔注射）麻醉大鼠。將麻醉后的大鼠仰臥位固定，備皮，術區消毒，鋪無菌洞巾，頸正中切口，暴露并分離右側頸總、頸外與頸內動脈，電凝頸外動脈的分支，結扎并離斷。將頸內動脈與頸外動脈之間的交通支凝斷，夾閉頸總動脈及頸內動脈，于頸外動脈殘端切口向頸內動脈插入栓線（18.0±0.5）mm，感覺有阻力即達大腦中動脈起始部，固定栓線，縫合傷口。缺血2h后拔出栓線，實現再灌注。大鼠缺血／再灌注6h后的神經功能評分采用Longa評分法［1］:0分為無神經功能缺失癥狀；1分為輕度局灶性神經功能缺失癥狀（不能完全伸展左側前肢）；2分為中度局灶性神經功能缺失癥狀（向左側轉圈）；3分為中、重度局灶性神經功能缺失癥狀（向左側傾倒）；4分為不能自發行走，意識水平降低。1～3分入組，0分和4分者均被剔除。到達時間點后，取材時發現蛛網膜下腔出血者也剔除，隨機補充。

1.2.2 腦組織IL－1β，IL－6含量測定 各組大鼠在腦缺血／再灌注2d，7d后斷頭取腦，于冰盤上迅速取缺血側大腦半球，用全蛋白提取試劑盒提取蛋白（南京凱基），低溫離心后留取上清液，采用ELISA測定IL－1β及IL－6，試劑購自R＆D公司，以上2個指標均按試劑盒說明操作。

1.2.3 腦組織NF－200免疫組織化學染色 將大鼠深度麻醉后開胸，用生理鹽水與4%多聚甲醛各150mL進行灌流，斷頭取腦，4%多聚甲醛液中固定4～6h，然后放入70%乙醇中送組織切片，片厚8μm。取相同層面切片分別做 HE染色和免疫組織化學染色。免疫組化采用S－P法，DAB顯色。所用抗NF－200的一抗濃度均為1∶100，購自博士德公司；S－P即用型工作試劑盒由北京中杉生物公司提供，免疫組化步驟按照試劑盒說明書操作。NF－200陽性蛋白的平均光密度值用Imagepro－Plus 6.0軟件進行測定，具體操作參考軟件教程。

2 結 果

2.1 神經功能評分 根據Longa等［1］評分法，術后6h缺血／再灌注組和CM治療組大鼠評分（共32只）達到3分的共7只（7／32，21.9%），2分的共19只（19／32，59.4%），1分的共6只（6／32，18.7%）。在缺血／再灌注后第7天，兩組大鼠的評分較前明顯改善（P＜0.05）；此外，CM治療組大鼠的神經功能改善程度較缺血／再灌注組更明顯（P＜0.01）。見表1。

表1 兩組大鼠缺血／再灌注后第2、7天神經功能評分（，分）

表1 兩組大鼠缺血／再灌注后第2、7天神經功能評分（，分）

正常組、假手術組評分為0；a:P＜0.05，與缺血／再灌注第2天比較；b:P＜0.01，與缺血／再灌注組比較。

組別 第2天 （n＝16） 第7天（n＝16）缺血／再灌注組 2.00±0.76 1.25±0.71a CM治療組 2.00±0.76 0.50±0.53ab

2.2 腦組織IL－1β，IL－6的含量 正常組和假手術組腦組織IL－1β、IL－6水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），缺血／再灌注后第2天，缺血／再灌注組與CM治療組腦組織IL－1β、IL－6水平均較正常組明顯升高（P＜0.01），但治療組明顯低于缺血／再灌注組（P＜0.01）。隨后IL－1β、IL－6逐漸下降，第7天時缺血／再灌注組和CM治療組IL－1β，IL－6水平較前明顯下降（P＜0.01），且CM治療組較缺血／再灌注組下降更明顯（P＜0.01），其中IL－6的水平與正常組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 腦組織NF－200 免疫組化檢測顯示正常組和假手術組大鼠皮質內神經元軸突形態規則，NF－200陽性纖維較長，排布均勻。缺血／再灌注2d組大鼠缺血側皮質神經元NF－200陽性纖維縮短且數量顯著減少（P＜0.01），排布紊亂；7d后陽性軸突數目有所增加，但仍低于正常水平（P＜0.01）。與相同時間點缺血／再灌注組相比，CM治療組軸突形態較規則，NF－200陽性纖維表達有所增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表3。

表2 各組大鼠腦組織IL－1β，IL－6含量的比較（，pg／mL）

表2 各組大鼠腦組織IL－1β，IL－6含量的比較（，pg／mL）

a:P＜0.01，與正常組比較；b:P＜0.01，與缺血／再灌注第2天比較；c:P＜0.01，與缺血／再灌注第7天比較。

指標 正常組 假手術組缺血／再灌注組第2天 第7天CM 治療組第2天 第7天IL－1β 426.00±35.43 430.38±36.36 873.50±68.41a616.75±37.46ab 649.50±29.95ab 489.25±43.89abc IL－6 585.38±82.52 592.25±38.17 936.88±99.57a776.88±52.77ab 808.38±67.33ab 639.50±52.52bc

表3 各組大鼠缺血／再灌注后第2、7天缺血側皮質NF－200的平均光密度值（）

表3 各組大鼠缺血／再灌注后第2、7天缺血側皮質NF－200的平均光密度值（）

a:P＜0.01，與正常組及假手術組比較；b:P＜0.01，與缺血／再灌注第2天比較；c:P＜0.01，與缺血／再灌注第7天比較。

組別平均光密度值第2天 第7天正常組0.333±0.064 0.333±0.064假手術組 0.315±0.117 0.317±0.118ab缺血／再灌注組 0.118±0.084a 0.207±0.037ab CM治療組 0.186±0.029ab 0.289±0.143bc

3 討 論

炎性反應是缺血性卒中的一個重要病理過程，缺血狀態下高濃度的炎性細胞因子可能參與了神經損傷。近期研究發現，IL－1等可激活局部血管內皮細胞和白細胞，誘導細胞大量牢固的黏附，導致微血管阻塞，從而加重腦細胞的損傷［3］。IL－6也是中樞神經系統缺血相關的重要炎癥反應分子之一，IL－1 mRNA和IL－6mRNA在中樞神經系統海馬結構和齒狀回均有定位［4］，IL－6水平在腦缺血／再灌注早期升高，認為可能與中性粒細胞和巨噬細胞的浸潤有關。在本實驗中，通過對大鼠缺血／再灌注第2天的腦組織勻漿進行ELISA檢測，作者發現IL－1β和IL－6均較正常時明顯增加，提示IL在腦缺血早期即參與了腦損傷的病理、生理過程。之后，在第7天，IL－1β和IL－6水平均有所回落，表明了自身調節啟動了內源性修復。

長久以來，中樞神經系統損傷后必然導致某些功能永久喪失的悲觀理念一直在生物醫學界占統治地位。然而，中樞神經系統損傷后喪失的功能是可以得到一定程度恢復的［5－6］。腦內神經元胞體只占據皮質總體積的3%，而軸突、樹突及神經膠質則占了97%，當部分神經元死亡時，存活細胞中豐富的軸突可通過側枝出芽的方式取代損傷的軸突，代償其功能［7－8］。NF是構成神經元胞體和神經軸突細胞骨架的主要成分，在維護神經元的功能和軸漿轉運等一系列與脊髓損傷修復相關的病理、生理變化中發揮著重要作用［9］。NF依據相對分子質量的不同可分為 NF－68、NF－140及 NF－200三種。其中 NF－200在正常情況下只存在于軸索中，而胞體不含或很少含有，故正常時NF－200胞體為陰性。有研究發現，在脊髓損傷區附近的神經元在創傷刺激及多種誘導因子的作用下，能大量合成及積存NF－200以適應神經再生的需要，此時NF－200可在神經元胞體內著色［10－11］。脊髓不完全損傷后 NF－200陽性神經元的數量及神經元胞體著色的程度與后肢的功能恢復情況有密切的關系，說明NF－200染色不僅能顯示傷后神經元的形態，也能反映其功能狀態［12］。在缺血／再灌注后，NF－200在皮質的表達明顯減少，這與神經元缺血／再灌注損傷的發生是一致的。軸突的損傷及缺失，必然對神經細胞間的功能聯系和傳遞有著不可避免的影響，因此大鼠的神經功能受損后恢復存在困難。這也與本實驗結果是一致的。

CM作為新一代的哌嗪類鈣離子拮抗劑，除了能夠抑制鈣離子內流、擴張血管外，研究還發現它能通過抑制腺苷脫氨酶的作用延遲腺苷的降解，減少肌酐和次黃嘌呤的生成，使腺苷在組織內蓄積。腺苷作為內源性保護因子在腦缺血損傷中表現出了顯著的自穩態調節及神經調節作用［13］。本研究運用CM對腦缺血／再灌注大鼠進行急性期治療，從減輕腦組織炎癥反應、促進軸突再生及改善神經功能3個方面，探討了CM對急性缺血性腦損傷的保護作用。CM治療組與缺血／再灌注組比較后發現:CM 能夠顯著抑制腦內IL－1β、IL－6的過度表達，明顯增加腦皮質NF－200的表達，還伴隨神經功能缺損的明顯改善。這些都提示，CM可能從以上環節對缺血性腦損傷發揮了較好的保護作用，且這種保護作用隨著用藥時間的延長更加突出。

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