梨形四膜蟲細胞毒性苯酚類似物的三維定量結構毒性相關研究＊

王遠強，劉躍輝，丁 元，張婭，林治華

（重慶理工大學藥學與生物工程學院 400054）

苯酚類化合物作為有機工業中一類重要的物質被廣泛地用作防腐劑、防銹劑、農業化學品、生物殺傷劑、染料、殺真菌劑和殺蟲劑等，其廣泛存在于環境中并對環境、尤其是水環境造成嚴重污染［1－4］。目前苯酚等4種酚類化合物被美國環境保護局列為優先控制的有機污染物，7種苯酚類化合物被確認為中國優先控制的有機污染物；因此，苯酚類化合物的毒性研究近年來成為熱點。定量構效關系（quantitative structure activity relationship，QSAR）研究在現代化學和生物化學研究領域得到了非常廣泛的應用，同時在環境污染物的生物活性和生物毒性評價中發揮著重要作用［5－7］。

定量結構毒性相關性（quantitative structure－toxicity relationships，QSTR）研究是指一組化合物的生物毒性與其結構特征之間的相互關系，是一種基于化合物結構預測其毒性，并能進一步分析毒性作用機制的研究方法。近年來，QSTR研究在環境污染物、毒性研究預測方面獲得了廣泛的應用。本文使用比較分子相似性指數分析（comparative molecular similarity indices analysis，CoMSIA）方法對系列具有梨形四膜蟲細胞毒性的苯酚類似物進行了三維定量結構毒性相關研究（3DQSTR），系統分析了立體場、靜電場、疏水場及協同作用對模型的影響，并建立了相應的3D－QSTR［9－11］。

1 CoMSIA的原理及研究方法

1.1 CoMSIA簡介 自CramerⅢ在1988年創建比較分子力場分析（CoMFA）方法以來，CoMFA已經發展成為三維定量構效關系（3D－QSAR）研究中使用最廣泛且最有效的工具之一［12］，它主要用于研究分子周圍的非鍵分子場（立體場與靜電場）改變時，其相應的活性所發生的變化［13－16］。1994年，Klebe等［16］提出CoMSIA方法，該方法是CoMFA的一種擴展，兩者的原理基本相同，都基于如下假設:分子的親和力改變時，其分子性質也發生相應變化，其分子性質以分子場的形式表現。

1.2 數據來源 本研究中50個具有梨形四膜蟲細胞毒性的苯酚類化合物來自文獻［9］，化合物名稱及其活性見表1，該類化合物的公共結構見圖1。在本研究中，從50個苯酚類似物中隨機選擇10個化合物組成測試集，用于測試3D－QSTR模型的預測能力；剩余的40個苯酚類似物則組成的訓練集建立3D－QSTR模型。

圖1 苯酚類化合物的公共結構

圖2 苯酚類化合物的分子疊合圖

1.3 分子疊合 本研究以毒性最強的苯酚化合物（2，4－二溴－6－苯基苯酚）作為模板，首先對該化合物進行系統搜索及分子力學優化，確定其最低能量構象，其他分子則以該分子為模板做結構修飾并進行能量優化，最后基于公共結構進行分子疊合。具體步驟為:首先選取活性最強的苯酚類化合物分子，對其進行系統構象搜索，選擇最低能量構象并用MMFF94力場進行分子力學優化；然后以該分子為模板構建其他分子，并用MMFF94力場進行分子力學優化，優化的收斂條件均為能量RMS值小于0.05KJ·mol·nm－1。

由于本文研究對象均為具有苯環結構的苯酚類化合物，所以認為是較剛性的分子，經過上述分子力學優化的構象即為化合物的活性構象，在分子疊合過程中，選擇活性最強的苯酚化合物（2，4－二溴－6－苯基苯酚）作為疊合模板，以公共結構（原子1－8）進行分子疊合，疊合后的分子骨架見圖2。

1.4 CoMSIA分析 在用CoMSIA分析時，首先在疊合后的所有分子集合區產生邊長為0.2?的格點，并用4?的邊界確定所有疊合分子的區域。用CoMSIA提供的缺省探針計算分子在每個格點上的立體場、靜電場、疏水場，在得到每個格點的分子場后，用偏最小二乘（partial least square，PLS）方法建立分子場參數與活性的3D－QSTR，并用“留一法”（leave one out，LOO），交互校驗（cross validation，CV）方法檢驗模型的統計學差異以及確定模型的主成分數，以最優的交互校驗值確定的主成分數并建立非交互校驗的3D－QSAR模型，模型質量由交互檢驗相關系數（Q2）、相關系數（r2）、預測標準差（standard error prediction，SEP）和F統計值評價。本研究的計算工作在SGI Fuel工作站用SYBYL6.9完成。

2 結 果

在本研究中，分別對訓練集化合物的立體場、靜電場、疏水場及不同分子場的協同進行CoMSIA分析，各3D－QSTR模型的統計結果見表2；在用PLS方法建立QSAR模型時，用最優Q2確定的主成分數建立非交互校驗相關模型。表2中的模型參數顯示:使用靜電場與疏水場協同作用建立的3D－QSAR模型具有較強的穩定性和良好的預測能力，該模型所用主成分數為4，Q2為0.767，r2為0.933，SEP為0.179，F檢驗值為157.914。使用CoMSIA方法分別對3種分子場建立3D－QSTR模型，其中相關性最好、預測能力最強的是用靜電場所建立的模型（Q2＝0.749，r2＝0.891），其次是用疏水場作用建立的模型，而用立體場（Q2＝0.040，r2＝0.229）預測能力相對較差，說明靜電場對化合物親和力的影響最明顯。在用任意兩種分子場所建立的模型中，用靜電場與疏水場建立的3D－QSTR模型具有相對最優異的預測能力（Q2＝0.767，r2＝0.933）；在該模型中，靜電場對模型的貢獻為67%；同時使用3種分子場所建模型中，靜電場的貢獻也達到59.1%。由此可見，靜電場對模型的貢獻是非常明顯的，而使用立體場與疏水場的協同作用則相對較差。分析表2中的所有QSTR模型可以發現，單獨使用立體場并不能建立一個理想的模型，但在有其他分子場存在的情況下立體場作用的貢獻明顯增強。

表1 苯酚類化合物對四膜蟲細胞毒性的觀察值與計算值

表2 苯酚化合物的CoMSIA模型參數

3 討 論

對于訓練集中，細胞毒性計算值與觀測值的絕對誤差小于0.335，說明所建立模型具有良好的估計能力，即靜電場和疏水場與細胞毒性的相關性非常好；在測試集的10個化合物中，有1個化合物的預測值出現了異常情況，即與觀測值的偏差比較大，但另外9個化合物的預測值與觀測值吻合得比較好，其絕對誤差最大為0.244。對于化合物2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚，其預測值與觀測值的絕對誤差達到了1.103，這可能是由于化合物中含有2個空間位阻較大的叔丁基所引起的，也可能是實驗觀測值本身存在一定誤差所致或實驗中的偶然誤差引起。

CoMSIA的一個優點就是可以分析各種分子場對毒性的影響，并可以通過3D相關性等值面圖進行觀察；該等值面圖有助于確定影響毒性的分子場重要區域，也可以標記對活性具有重要貢獻的分子場特征。苯酚類化合物的靜電場、疏水場等值面圖如圖3、4所示。結合靜電場的等值面圖中（圖3）與具體的化合物進行分析可知:在6位（紅色區域）有相對較大的基團時，使用負電性較強的取代基可以增加化合物的毒性，在2、3、5位（藍色區域）附近的區域則應該使用正電性較強的取代基。疏水場相關性等值面圖（圖4）顯示:在分子的2～5位取代位置上都不適合有立體位阻較大的基團。

圖3 CoMSIA分析靜電場等值面圖

圖4 CoMSIA分析疏水場等值面圖

Cramer等［13］采用量子化學方法對該系列苯酚類化合物進行QSTR，作者分別使用AM1、PM3、PM5與DFT方法計算了苯酚的分子質量（Mw）、最高能量軌道（εHOMO）、最低能量軌道（εLOMO）、硬度（η）、柔軟性（S）、化學勢（μ）、親電指（ω）數及總能量（TE），建立了良好的定量結構毒性相關模型（表3）。盡管本文使用CoMSIA方法所建立的模型與文獻研究結果相比沒有優勢，但是CoMSIA從三維空間結構討論苯酚類似物的靜電性質、空間結構與疏水性質對其細胞毒性的影響，并可通過分子等勢面圖為苯酚類似物的設計與改造提供直接依據。

表3 苯酚化合物的定量構毒關系模型對比

綜上所述，使用靜電場與疏水場建立的3D－QSTR模型，具有良好的穩定性與預測能力。分子場等值面圖可直觀反映出細胞毒性有重要影響的重要部位，并可由此推測在6位上有較大的負電性基團及2～5位上有帶正電荷的取代基對增強細胞毒性有利。將本研究中的3D－QSTR模型與2D－QSTR研究相結合，對苯酚類化合物進行結構修飾以改善其細胞毒性具有重要意義。

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