矮化黃瓜膨脹素Cs-EXPA1基因的表達差異研究

王多佳，李鳳蘭，任明玄，胡寶忠

（東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

黃瓜（CucumissativusL.）為葫蘆科（Cucurbitaceae）甜瓜屬（Cucumis）一年生草本攀援植物，是重要的蔬菜作物，栽培廣，面積大，在蔬菜供應和國民經濟中均占有重要地位[1]。我國是世界上黃瓜生產面積最大、總產量最高的國家。我國廣泛栽培的黃瓜品種多為蔓生品種，由于植株高大，需要人為搭架，造成大量的人力、物力的浪費，嚴重地影響了我國黃瓜產業的發展。矮生性狀是高等作物理想株型性狀的一個重要方面，矮化（桿）品種抗倒伏能力強，適宜高度密植，群體光能利用率高[2-3]。本文中所用矮化黃瓜D0462，其表型為植株矮小（只有30 cm高），節間縮短，幾乎不分枝，呈現出直立、緊湊的株型。

膨脹素（Expansin）是植物細胞壁松弛蛋白，主要參與細胞的生長、伸長和一系列細胞壁的修飾過程。它能緩釋細胞壁結構網中的張力，使細胞壁變得松弛，因此多被譯為膨脹素[4]。Cs-EXPA1基因是最早在黃瓜下胚軸中被發現的膨脹素基因，在對膨脹素近十年的研究中發現，它參與了許多植物生長發育過程的調控，比如細胞生長、葉原基的產生、花粉管滲入、果實成熟、細胞壁降解、種子的生長和萌發等，而且它還對淹水、光處理、旱脅迫等產生反應[5-8]。但與矮化的關系尚未見報道，因此開展黃瓜矮化突變體膨脹素基因的分離克隆研究，這將對于探討植物的矮化機理具有重要作用。

本研究克隆了黃瓜下胚軸、根、子葉組織中的膨脹素基因Cs-EXPA1，研究了它在黃瓜生長苗期不同部位的表達量差異，通過與正常株高的對照組的表達量比較，探討了膨脹素基因在矮化黃瓜生長發育中的作用，為利用基因工程技術改變膨脹素在矮化植株中的表達以便增加作物產量提供有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

矮化黃瓜D0462，對照材料為長蔓正常株高品種129，均由東北農業大學園藝學院黃瓜課題組提供。在培養箱中28℃光培養16 h，25℃暗培養8 h，分別于破土后16、24、40、48、64、72、88、96 h取D0462和129的下胚軸、根和子葉作為試材。

1.2 RNA的提取、cDNA的合成及黃瓜Cs-EXPA1基因的克隆

用Trizol法（Invitrogen公司）提取RNA，用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT-PCR Kit反轉錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈，根據Cs-EXPA1序列（GenBank登錄號U30382.1），設計合成一對引物，上游R1：5'TTCGCTAATCTCCCCTTTCTTCC 3'， 下 游 R2： 5'GTCGTTCGCGTTTTGTTGTTGTT 3'。以第1鏈cDNA為模板進行擴增，反應條件為94℃5 min；94℃30 s；57℃30 s；72℃30 s；共35個循環，最后72℃延伸10 min。反應產物從1%瓊脂糖凝膠上回收后，克隆入pMD-18T載體（TaKaRa），轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒鑒定后由南京博仕公司測序。

1.3 Cs-EXPA1基因在苗期不同組織中的Realtime PCR表達分析

TaqMan探針法測定Cs-EXPA1基因的不同時空表達情況，利用Primer Express 2.0設計熒光定量探針引物。在檢測探針所在靶序列的兩端設計普通引物，擴增200～500 bp片段作為陽性克隆基因。引物序列為上游：5'TACTTCAACCTCGTTTTGATCACA 3'；下游：5'CGAGACCCCTTTATCGACACA 3'；探針：FAM-TGGCGCAGGCGACGTCCA-BHQ1。以黃瓜β-actin為內參，上游：5'GTGTGAGTCACACTG TTCCCATC 3'；下游：5'AGCAAGGTCCAAACGG AGAA 3'；內參探針：FAM-AGGGTTACGCCCTCC CTCATGCC-BHQ1。由南京博仕公司合成。預變性95℃30 s，PCR反應40個循環，95℃5 s，60℃34 s。Real-time PCR用ABI7500熒光定量PCR儀，按照試驗手冊進行。試驗結束后確認實時PCR的擴增曲線，設3次重復，根據2-ΔΔct法測定基因的相對定量。

2 結果與分析

2.1 Cs-EXPA1基因的克隆

采用Trizol試劑盒（Invitrogen）提取苗期黃瓜D0462和129的下胚軸、根、子葉的總RNA，取1 μg總RNA作為反轉錄的模板，反轉錄體積10 μL，分別取2 μL做模板，以R1、R2為引物擴增目的基因，按照擴增條件，35個循環，1%瓊脂糖凝膠電泳，如圖1所示。將目的片段膠回收，并與pMD-18T（TaKaRa）載體連接，轉化，挑取白斑，經測序比對結果見圖2。

圖1 Cs-EXPA1基因PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification result of Cs-EXPA1

2.2 Cs-EXPA1基因在苗期不同組織中的Realtime PCR表達分析

Cs-EXPA1基因在黃瓜矮化突變體D0462和正常品種129下胚軸中的變化趨勢相似，如圖3所示，在96 h內的生長時期中都有表達量的峰值，D0462在64 h處達到峰值，幾乎是平均水平的70倍，隨后急劇下降，品種129則在72 h處達到峰值，表達量是平均水平的15倍左右。在其他的測試時間內，D0462的表達量都略高于129。

從圖4中我們可以看出，品種129子葉中Cs-EXPA1的表達量要遠大于D0462，矮化突變體的子葉中Cs-EXPA1的表達基本保持在低水平上，但是品種129中子葉的Cs-EXPA1基因從24 h后逐漸增加，到64 h后達到峰值，隨即降低，到96 h時與D0462的表達量基本持平。說明在24～72 h之內是正常黃瓜子葉膨脹素基因Cs-EXPA1大量表達的重要時期。

圖2 Cs-EXPA1基因在NCBI上的比對結果Fig.2 Blast result of Cs-EXPA1 in NCBI website

圖3 Cs-EXPA1基因在黃瓜下胚軸中的表達Fig.3 Expression of Cs-EXPA1 gene in hypocotyl of cucumber

圖4 Cs-EXPA1基因在黃瓜子葉中的表達Fig.4 Expression of Cs-EXPA1 gene in cotyledon of cucumber

從圖5中我們可以看出，根中Cs-EXPA1基因的表達相對于下胚軸和子葉來說表達量很少，對于D0462，其根中Cs-EXPA1的表達基本沒有顯著的增長或者降低，基本保持在相當少的水平上，只在24和88 h時略微增長，而正常品種129根中Cs-EXPA1則在96 h處顯著增加，達到平均水平的10倍左右。這也說明此時129根中膨脹素基因的開始大量表達并對根細胞起作用。

圖5 Cs-EXPA1基因在黃瓜根中的表達Fig.5 Expression of Cs-EXPA1 gene in roots of cucumber

3 討論與結論

膨脹素是近年來發現的迄今唯一能誘導熱鈍化的離體細胞壁伸展的細胞壁特異性蛋白質。在控制植物細胞生長方面，能調節細胞壁的膨脹，可以通過生長素調控，引起pH下降，激活膨脹素及相關水解酶，引起木葡聚糖或（1，3），（1，4）-β-D-葡聚糖（MLG）等半纖維素的降解，打斷半纖維素與纖維素微纖絲之間的氫鍵，改變細胞壁的承重網絡，從而加速生長[9-10]。此外，膨脹素對植物發育也起一定的調控作用，但只在正確的位置和時間內刺激細胞生長，是細胞壁中的一種發育決定成分。

本研究獲得的Cs-EXPA1是最早在黃瓜下胚軸中發現的膨脹素蛋白基因之一，從本試驗中可以確定該基因在子葉與根中都有表達，并且通過Real-time PCR定量分析得出Cs-EXPA1基因在不同的部位的表達量不同，膨脹素Cs-EXPA1基因在下胚軸中的表達量最高，在子葉中次之，在根中的表達量最低。并且Cs-EXPA1基因的表達具有時空特異性，隨時間的變化，在不同組織部位或同一組織不同發育時期的表達活性各不相同，這與前人得到的結果一致[11-13]。

同時，矮化黃瓜與正常長蔓品種相比膨脹素Cs-EXPA1基因的表達量也有明顯差異，在矮化黃瓜D0462的子葉和根中Cs-EXPA1的表達量要小于正常的黃瓜品種129，并且隨時間變化不大，但在下胚軸中64 h的表達量卻遠大于品種129。據報道，黃瓜植株株高是由單基因體系和多基因體系共同決定的[14]，所以，在矮化黃瓜中膨脹素Cs-EXPA1單個基因的表達量不能決定植株的矮化。

膨脹素活性也是重要的因素，Cosgrove等在研究燕麥胚芽鞘時發現，對黑暗培養4 d的燕麥胚芽鞘照白光處理，8～10 h之后，生長陡然停止，外源生長素也不能誘導生長恢復[15]，同時，細胞壁中的廣泛生長因子膨脹素的活性沒有下降，只是量上有稍微的降低，隨著照光的持續，生長才逐漸恢復[16]。推測光照對膨脹素活性的調控有很大的影響。

目前，蔬菜作物上矮化基因的研究尚處于起步階段，不同株型的矮生類型如何利用也有待深入研究，另外，利用分子生物學技術進行矮化機理的研究也比較薄弱，同時膨脹素如何促使植物細胞壁松弛與伸長的具體機制尚不清楚，這都有待進一步研究。

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