堿脅迫應答GsGASA1及GsGASA2基因表達特性研究

李昆侖，柏 錫，盧 姍，袁 悅，李 勇，紀 巍，才 華，季佐軍，朱延明

（東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

植物的逆境應答是一個很復雜的生物學過程，當植物受到外界環境脅迫后，會引發體內一系列的生理生化反應，并最終通過信號傳導過程誘導或者抑制某些基因的表達，以避免或減少逆境對自身的危害[1]。近年來，通過基因芯片等分子生物學技術，篩選出一批受逆境誘導表達的基因[2]。野生大豆是栽培大豆的近緣野生種，在我國分布廣泛，類型豐富。具有抗逆性和適應能力強、產量性狀突出等眾多優良性狀，野生大豆具有很強的抗逆性和適應能力，是利用基因工程手段進行作物抗逆分子育種的重要基因來源供體材料[3]。

GASA（Gibberbllic acid-stimulated inArabidopsis）基因家族是近年來研究較多的一類受GA調控的基因家族[4]。第一個被發現的GASA基因家族成員是由Shi等在赤霉素缺失的番茄突變體gib1中分離得到的，后陸續從番茄[5]、矮牽牛[6]、馬鈴薯[7]、水稻[8]、非洲菊[9]、擬南芥[4]等中獲得了同源基因。已有的研究表明，大多數GASA基因受GA調控。例如，GA誘導番茄中GAST1的表達，而GAST1的另一個同源基因RSI-1的表達則受生長素的誘導[5]；赤霉酸（GA3）誘導矮牽牛中分離得到的4個GIP同源基因（GIP1、GIP2、GIP4和GIP5）的表達[6]；GA3促進水稻和GA合成缺失突變體中OsGASR1和OsGASR2的表達[8]；GA誘導非洲菊（Gerbera hybrida）GEG基因在花冠和心皮中表達[9]。在非生物脅迫方面，研究表明GASA基因可以響應多種逆境脅迫并在其中起到重要作用，如Snakin-2基因在受到機械損傷下顯著上調表達，超量表達后可以提高對病原體的抵抗能力[7]；擬南芥GASA4基因的表達在熱激處理下短時間內迅速積累[10]，超量表達后也提高了轉基因植株耐熱性[10]。

本研究在前期構建的野生大豆堿脅迫芯片表達譜中選取了兩個在堿脅迫中顯著上調表達并且經生物信息學預測屬于GASA基因家族的基因[11]，分別命名為GsGASA1、GsGASA2。進一步檢測其在不同非生物脅迫條件及激素處理下的表達模式，為研究GsGASA1和GsGASA2基因在植物逆境脅迫應答方面的功能及其作用機制奠定了基礎，也為綜合改良作物耐鹽堿能力提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為野生大豆（G07256），采自吉林省白城地區鹽堿地，由東北農業大學植物生物工程研究室提供。

1.2 野生大豆的處理

用濃硫酸處理10 min以消化泥膜，蒸餾水洗凈，播種于由營養土和蛭石按1∶1比例配制成的基質中，培養21 d后，洗凈根部，分別用50 mmol·L-1NaHCO3、100 mmol·L-1NaCl、30%PEG（W/V）、4 ℃、100 μmol·L-1GA3、10 μmol·L-1PAC、100 μmol·L-1ABA進行處理，以未處理的野生大豆幼苗作為對照（0 h），取樣時間為處理后0.5、1、3、6和12 h。用NaHCO3處理的材料，取幼嫩的根和葉，其他方式處理的材料，取幼嫩的根。

1.3 總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成

采用天根公司RNA提取試劑盒并按照其說明提取總RNA。取RNA 5 μg，采用Invitrogen公司的SuperScript II反轉錄酶試劑盒合成雙鏈cDNA。

1.4 生物信息學預測

應用在線工具InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/）預測目的基因編碼的蛋白質的結構域、信號肽和跨膜區。利用DNAMAN分析蛋白質序列之間的相似性。

1.5 半定量RT-PCR分析

內參采用β-Actin，擴增程序為94℃預變性7 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，26個循環。GsGASA1、GsGASA2基因的表達分析使用相應數量的cDNA，反應條件與內參的相同，PCR擴增均進行26個循環。用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。進行兩次重復。應用ImageJ軟件（http://rsbweb.nih.gov/ij/）計算目的基因的相對吸光值。所用的引物序列如下：

GsGASA1-Sense 5'CACATATCATAGCAATGGC AGCAC 3'；

GsGASA1-RTSense 5'ATTTGGGTCCTCCTTCCT TGG 3'；

GsGASA2-Sense 5'AATGGCTAAGTTCTTTGCTG CTATG 3'；

GsGASA2-RTSense 5'CTCCTTCCTTGGTCTTCC AGTTG 3'；

β-Actin-Sense 5'GAAGATGGCAGACGCTGAG GAT 3'；

β-Actin-Antisense 5'ACGACCTACAATGCTGG GTAACAC 3'。

2 結果與分析

2.1 GsGASA1、GsGASA2基因的獲得

利用實驗室前期構建的野生大豆堿脅迫基因芯片表達譜，篩選得到了兩個在鹽堿脅迫下明顯上調的候選基因（probset分別為Gma.15958.1.S1_at；GmaAffx.90343.1.S1_at)。根據芯片雜交結果，這兩個基因在栽培大豆基因組數據庫中對應同源基因的GlymaID分別為Glyma02g41280.1、Glyma18g49400.1。應用在線工具Interproscan對Glyma02g41280.1、Glyma18g49400.1基因編碼的蛋白質序列進行結構域、信號肽和跨膜區預測（見圖1）。預測結果表明，這兩個基因都具有GASA基因家族共同的結構特征，由100個左右氨基酸組成，在N端均有一可剪切的信號肽，分別由27、24個氨基酸組成，因此可能屬于分泌蛋白。在緊接信號肽下游，含有一個親水區域，由22～23個親水氨基酸組成。C端含有60個氨基酸的GASA結構域，其中包括12個保守的半胱氨酸殘基，跨膜結構預測表明兩個蛋白在N端都有一個跨膜區。根據野生大豆和栽培大豆之間序列的高度相似性，推測野生大豆中的這兩個基因也屬于GASA基因家族，因此分別命名為GsGASA1、GsGASA2基因，并且推測GsGASA1和GsGASA2基因編碼的蛋白質也同樣屬于分泌蛋白，它們各自的信號肽可能將引導其成熟產物定位于細胞壁。另外，由于GsGASA1、GsGASA2基因序列較短，僅編碼100個左右的氨基酸，可以推測C端60個氨基酸構成的GASA結構域對基因的功能是非常重要的。利用DNAMAN對Glyma02g41280.1與Glyma18g49400.1基因所編碼的蛋白質序列進行比對，發現二者一致性達60%（見圖2）。同樣根據野生大豆和栽培大豆序列的高度相似性，我們可以推測GsGASA1基因和GsGASA2基因分別所編碼的蛋白質序列之間的相似性也在60%左右。

2.2 GsGASA1、GsGASA2基因芯片結果的sqRTPCR驗證

野生大豆中NaHCO3處理下GsGASA1、GsGASA2基因的sqRT-PCR驗證結果表明（見圖3），GsGASA1基因在根中于0.5 h時出現顯著上調表達，這種上調趨勢維持到1 h，在3 h開始下降，在處理6 h時再次出現上升，隨后在12 h恢復至處理前的表達水平。GsGASA2基因在根中也于0.5 h時出現顯著上調表達，而后一直到處理12 h都呈現下降的趨勢。因此，堿脅迫處理下，GsGASA1、GsGASA2基因在野生大豆根中的sqRT-PCR結果和在基因芯片表達譜中表達模式相比較[11]，雖然GsGASA1、GsGASA2基因的表達峰度大小存在一定差異，但是變化趨勢一致，均呈現在根中堿脅迫處理短時間內迅速上調表達隨后恢復到最初的表達水平的變化模式，進一步驗證了基因芯片結果。另外，在葉中，GsGASA1基因的表達量出現先下降再上升的趨勢，最終回到脅迫處理前的表達水平。GsGASA1基因在根和葉中表達模式的不同表明在堿脅迫反應中GsGASA1基因在野生大豆不同部位所參與的調控模式不同。而GsGASA2基因可能由于時間延遲的原因在處理3 h才出現明顯上調表達，隨后下降至處理前的表達水平。以上結果表明，GsGASA1和GsGASA2基因均響應堿脅迫，作為候選基因用于下一步試驗。

2.3 非生物脅迫及激素處理下GsGASA1、GsGA SA2基因的表達情況

通過sqRT-PCR來檢測野生大豆根中GsGA SA1、GsGASA2基因在另外三種非生物脅迫—鹽、干旱、低溫處理下的表達情況。圖4的結果表明，GsGASA1、GsGASA2基因均可以被NaCl、PEG、4℃誘導表達。然而兩個基因在這三種脅迫處理下的表達模式是不同的，GsGASA1基因在三種脅迫處理下，均迅速在0.5 h出現明顯上調表達，特別是在干旱處理下，在1 h達到高峰，隨后下降。GsGASA2基因在NaCl處理下，也在0.5 h出現上調，但直到12 h才開始下降，而在干旱處理下，表達變化沒有GsGASA1基因的顯著，但也在短時間內上調，在3 h達到最大值。綜上所述，GsGASA1、GsGASA2基因除了響應堿脅迫外，還參與到鹽、干旱、低溫三種脅迫中，并且在這四種脅迫處理中均呈現在短期內顯著上調表達的模式。通過蛋白質序列比對分析發現GsGASA1與GsGASA2基因所編碼的蛋白質序列一致性較高（達60%左右），這可能是GsGASA1與GsGASA2基因在堿、鹽、干旱、低溫四種非生物脅迫以及激素處理下表達模式相似的原因。由此我們推測GsGASA1和GsGASA2基因在植物應答非生物脅迫反應中將起到一定作用。

圖1 Glyma02g41280.1、Glyma18g49400.1基因InterProScan預測結果Fig.1 Predict result of Glyma02g41280.1,Glyma18g49400.1 by InterProScan

圖2 Glyma02g41280.1、Glyma18g49400.1基因編碼蛋白質序列比對結果Fig.2 NCBI Blast result of Glyma02g41280.1,Glyma18g49400.1 amino acid sequence

圖3 GsGASA1、GsGASA2基因在NaHCO3脅迫的表達特性分析結果Fig.3 Expression patterns of GsGASA1,GsGASA2 gene in response to NaHCO3treatments

圖4 野生大豆根中GsGASA1、GsGASA2基因在不同非生物脅迫、不同激素處理的表達模式Fig.4 Expression patterns of the GsGASA1,GsGASA2 gene in response to various treatments and plant hormones

另外，GA3處理下GsGASA1基因在12 h明顯上調表達，GsGASA2基因在處理6 h時就開始上升，但是上升程度沒有GsGASA1基因顯著，而在GA生物合成抑制劑PAC處理下，GsGASA1、GsGASA2基因的表達均明顯受到抑制（見圖4）。因此GsGASA1、GsGASA2基因的表達可能受到GA的誘導。而GsGASA1、GsGASA2基因在GA處理下表現出先下調才上調的表達特點，可能與GA信號通路的反饋抑制特點有關。另外，在與GA互為拮抗劑的ABA處理下，GsGASA1、GsGASA2基因均表現出明顯下調的趨勢。因此，可以推測GsGASA1與GsGASA2基因的表達均受到GA的誘導以及ABA的抑制。

3 討論與結論

通過野生大豆中GsGASA1與GsGASA2基因在堿、鹽、干旱、冷脅迫下能被誘導表達的試驗結果，可初步證明GsGASA1與GsGASA2基因均響應多種非生物脅迫，進而可能與野生大豆的耐逆性有關，這為以后進行GsGASA1、GsGASA2基因全長基因的克隆以及在非生物脅迫方面的功能驗證奠定了基礎。大多數GASA基因的表達都受GAs的正向調控，如GA促進GASA家族中的GIP1[6]、GEG[9]、AtGASA4[4]、OsGASR[8]等的表達。對野生大豆施加外源GA3和ABA處理后，GsGASA1、GsGASA2基因表達分析的試驗結果表明（見圖4），GsGASA1、GsGASA2基因對外源激素的響應基本一致，都受GA3的誘導，受PAC和ABA的抑制。說明GsGASA1、GsGASA2基因可能受GA和ABA的雙重調控。本研究結果表明，GsGASA1、GsGASA2基因可能是GA和ABA這兩種重要植物激素信號的整合子，為研究GA和ABA的相互作用提供了重要線索。下一步準備將GsGASA1與GsGASA2基因對模式植物擬南芥超量表達，從而分析其在非生物脅迫處理下的抗性以及進一步探討功能機理。

本研究在前期構建的野生大豆堿脅迫基因芯片表達譜中選取了兩個經生物信息學預測屬于GASA家族的兩個基因，分別命名為GsGASA1、GsGASA2，通過sqRT-PCR驗證了芯片結果。另外，發現GsGASA1與GsGASA2基因除了響應堿脅迫處理外，均還受到鹽、干旱以及低溫脅迫的誘導表達，并且在這四種非生物脅迫處理下均呈現短期內顯著上調表達的模式，推測GsGASA1與GsGASA2基因可能在植物逆境脅迫應答反應中起到作用。另外GsGASA1與GsGASA2基因的表達均受到GA的誘導和ABA的抑制。本研究將為研究GsGASA1和GsGASA2基因在非生物脅迫中的功能以及在GA和ABA信號通路中的作用奠定基礎。

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