RT-PCR法克隆廣譜抗病基因TGA2及其植物表達載體構(gòu)建

劉永光，劉克鋒，孫向陽

（1.北京林業(yè)大學水保學院，北京 100083；2.北京農(nóng)學院城鄉(xiāng)發(fā)展學院，北京 102206）

系統(tǒng)獲得性抗性（Systematic acquired resistance，SAR）是植物抵御病原菌侵染的最有效手段[1]，我們可以利用SAR信號傳導途徑中的關(guān)鍵功能基因來啟動植物自然防御系統(tǒng)，達到廣譜抗病的目的。NPR1基因在植物的SAR發(fā)生中起著重要的作用，通過NPR1基因的過量表達可以誘導植物SAR的起始，使植物產(chǎn)生對多種病原菌的廣譜抗病性[2]。TGA2轉(zhuǎn)錄因子能直接和NPR1及其他多個病程相關(guān)基因啟動子結(jié)合，從而啟動SAR下游抗病基因的表達，增強病程相關(guān)蛋白的表達水平，特異的誘導植物產(chǎn)生SAR，從而啟動植物的廣譜抗病[3-4]。

TGA轉(zhuǎn)錄因子因為其序列中含有TGACG/as-1元件而得名。近年來，因其能夠識別和結(jié)合植物的SAR反應(yīng)的相關(guān)基因，促使SAR相關(guān)反應(yīng)的啟動，關(guān)于該轉(zhuǎn)錄因子家族的研究逐步深入，在模式植物擬南芥中，TGA家族現(xiàn)在共分離出六個成員，TGA1到TGA6，主要與植物的抗逆性和衰老等生理過程有關(guān)[5-6]。病原菌、傷害和植物激素類物質(zhì)等多種外界因素均能誘導TGA基因的表達[7]。TGA轉(zhuǎn)錄因子可以和植物的廣譜抗病基因NPR1的錨定重復序列相互作用。轉(zhuǎn)錄因子TGA2還能直接和NPR1下游的PR1基因啟動子感應(yīng)SA的調(diào)節(jié)元件結(jié)合[8]。

轉(zhuǎn)錄因子TGA2還能直接和NPR1下游的PR1基因啟動子感應(yīng)SA的調(diào)節(jié)元件結(jié)合[9]。TGA轉(zhuǎn)錄因子對植物抗病過程調(diào)節(jié)的原理總結(jié)如下[8-9]：

圖1 TGA轉(zhuǎn)錄因子對植物抗病基因的調(diào)節(jié)Fig.1 Regulation pattern of TGA factors on plant disease-resistance gene

在水稻中發(fā)現(xiàn)，TGA2轉(zhuǎn)錄因子可以與PR1基因上有的啟動子區(qū)域結(jié)合，將誘導信號轉(zhuǎn)變成細胞反應(yīng)，從而啟動SAR[10]。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，TGA2、TGA5、TGA6對植物系統(tǒng)獲得性抗病性的啟動非常重要[11]。當對這三個基因分別進行敲除的時候，擬南芥中可以誘導SAR的啟動，增強抗病性；全部進行敲除的情況下，不能夠啟動SAR和增強抗病性。這說明這三個轉(zhuǎn)錄因子的功能存在重疊[12]。在煙草中也發(fā)現(xiàn)，過量表達TGA2轉(zhuǎn)錄因子可以有效的增加PR相關(guān)基因的表達，增強植物的抗病性；而煙草TGA2失活突變體在SA處理后，不能夠誘導SAR的啟動，說明TGA2轉(zhuǎn)錄因子在SAR中起正調(diào)控作用[13]。與此同時，在轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草中，通過過量表達TGA轉(zhuǎn)錄因子或者將其基因沉默和敲除，發(fā)現(xiàn)TGA2和TGA5也存在一定的負調(diào)控作用[14]；研究還發(fā)現(xiàn)，TGA轉(zhuǎn)錄因子家族中TGA2、TGA3和NPR1基因的錨定結(jié)合力最強，TGA5、TGA6相對較弱[15]；TGA2可以在植物的所有組織中表達，TGA1和TGA3主要在植物的由內(nèi)組織和合根中表達[16]。

總之，TGA2轉(zhuǎn)錄因子能直接和多個病程相關(guān)基因啟動子結(jié)合感應(yīng)SA的調(diào)節(jié)元件結(jié)合，能夠增強病程相關(guān)蛋白的表達水平，特異的誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗病性，從而達到廣譜抗病的目的[17]。

本文采用RT-PCR的方法從擬南芥基因組中克隆TGA2轉(zhuǎn)錄因子，并將其構(gòu)建入植物表達載體中，期望通過轉(zhuǎn)化誘導目標植物的SAR反應(yīng)的啟動，相當于使目標植物體內(nèi)保持一種高抗病的免疫水平，從而達到廣譜抗病的目的，得到廣譜抗病植株。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為本實驗室所保存的擬南芥，反轉(zhuǎn)錄由TaKaRa公司的BcaBESTTM RNA PCR KitVer.1.1反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成，限制性內(nèi)切酶購自大連TaKaRa有限公司，T載體為購自Promega公司的pGEM-T Vector；引物由上海Sangon公司合成，測序由上海Sangon公司完成，T4DNA連接酶購自NEB公司，大腸桿菌菌株為DH5α。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank上所提供的TGA2基因的全序列，設(shè)計一對引物。上游引物：5'T↓CTTAGACA TATGGCTGATACCAGTCCGAG 3'；下游引物：5'CC C↓GGGTCACTCTCTGGGTCGA 3'。在上下游引物的5'端分別加上了XbaⅠ和SmaⅠ酶切位點。

1.2.2 擬南芥基因組RNA的提取

采用Invitrigen公司的Trizol Reagent提取擬南芥總RNA，方法參考《分子克隆實驗指南》[18]和《現(xiàn)代分子生物學實驗手冊》[19]改良。

1.2.3 RT-PCR擴增

以水代替植物RNA作為負對照，擬南芥總RNA為模板，選用TaKaRa公司的BcaBESTTM RNA PCR KitVer.1.1反轉(zhuǎn)錄試劑盒，進行mRNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以合成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增出目的基因。

PCR擴增的反應(yīng)條件為：94℃3 min；94℃30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 15 s（34個循環(huán)）；72℃10 min，4℃短期保存。

1.2.4TGA2基因的切膠回收及與T載體的連接

將目的條帶在紫外透射儀下切下，采用TaKaRa的膠回收試劑盒，按照操作步驟進行膠回收，然后與pGEM-T載體連接。利用PCR產(chǎn)物在3'末端自動加A及pGEM-T載體上多克隆位點處突出T的特點，在10 μL連接體系中加入以下成分：PCR回收產(chǎn)物3 μL，pGEM-T vector 1 μL，2×buffer 5 μL，T4DNA連接酶1 μL，總反應(yīng)體系為10 μL，4℃連接過夜。

1.2.5TGA2基因的測序

將連接好的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在含有X-gal和IPTG的LB+Amp選擇抗性平板上篩選白色菌落。對重組子進行PCR鑒定和酶切鑒定，選擇鑒定結(jié)果正確的送上海生工公司測序。

1.2.6TGA2基因表達載體的構(gòu)建

將TGA2基因與pGEM-T載體連接所得到的載體命名為pGEM-TGA2。將pGEM-TGA2載體和p35STnos載體分別進行SmaⅠ/XbaⅠ雙酶切，回收含有TGA2的片斷和p35STnos載體片斷，用T4DNA連接酶連接得到目的載體p35ST-TGA2。

2 結(jié)果與分析

2.1 所提取的擬南芥RNA

從圖2中可以看出，通過TRIzol Reagent法所提取的擬南芥，28S、18S、5S三條帶都有，說明RNA的完整性比較好；28S亮度雖然沒有達到18S亮度的2倍，但5S條帶并沒有明顯變亮，說明RNA提取過程中沒有發(fā)生降解，可作為模板用于擴增TGA2基因。

圖2 所提取的擬南芥RNAFig.2 RNA of Arabidopsis thaliana

2.2 TGA2基因的RT-PCR擴增

測序結(jié)果顯示所克隆基因全長993 bp，用DNAman軟件對測序結(jié)果和NCBI上所公布的序列進行比對可知：所克隆基因與NCBI上所公布的序列99.80%同源。所克隆基因在317和500 bp處出現(xiàn)了兩個堿基的置換。對序列進行翻譯后發(fā)現(xiàn)，這兩個置換并沒有導致TGA2基因氨基酸序列的改變，屬于正常的密碼子的第三位堿基的擺動。所克隆基因含有TGA2轉(zhuǎn)錄因子的起始密碼子ATG和終止密碼子TGA，是完整的TGA2基因（見圖3）。

圖3 所克隆TGA2序列與NCBI上所公布序列的比對Fig.3 Blast between the amplification of TGA2 and the original sequence of NCBI

2.3 TGA2植物表達載體的構(gòu)建

以EcoRⅠ/SacⅠ對pBI121酶切，回收T-nos片段，插入用同樣雙酶切的pCAMBIA3300中構(gòu)建中間載體p3300-Tnos；以HindⅢ/XbaⅠ酶切p3301-BI121，回收CaMV35S片段，插入用同樣酶切的p3300-Tnos中構(gòu)建中間載體p3300-35ST；質(zhì)粒pT-TGA2用XbaⅠ/SmaⅠ限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，回收含有TGA2基因的1.0 kb的目標片段，插入以同樣酶切處理的p3300-35ST中，篩選陽性克隆即得植物表達載體p35ST-TGA2（見圖4）。

圖4 p35ST－TGA2植物表達載體構(gòu)建過程Fig.4 Construction of p35ST-TGA2 plant expression vector

圖5 TGA2基因的反轉(zhuǎn)錄PCR擴增Fig.5 RT-PCR amplification results of TGA2 gene

2.4 TGA2基因植物表達載體的PCR及酶切檢測

TGA2基因植物表達載體的PCR及酶切檢測具體結(jié)果見圖5、6。

由圖5可以看出，以p35ST-TGA2質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，得到TGA2目的條帶。

由圖6可以看出，將所構(gòu)建的p35ST-TGA2載體用XbaⅠ單酶切，得到一條帶，而且大小正確。

將載體和基因內(nèi)部都含有的HindⅢ單酶切，得到兩條帶，大小正確；將載體用XbaⅠ/SmaⅠ雙酶切，得到兩條帶，大小正確。

以上檢測證明，所得到的目的載體構(gòu)建正確。

圖6 載體酶切鑒定Fig.6 Enzyme digestion results of plant expression vector p35ST-TGA2.Ⅵ

3 討論

植物抗病育種中缺乏可以直接利用的抗源，常規(guī)育種很難得到抗病品種。利用基因工程技術(shù)為植物抗病育種提供了新的途徑，但在以往的工作中，大部分的研究者將注意力集中于那些有直接抗菌活性的物質(zhì)，例如幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶，它們盡管在體外有抑菌活性，并且也獲得了一些轉(zhuǎn)基因抗病性提高的植株，但是很難達到高抗水平。

一個轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多個與同類性狀有關(guān)的基因的表達，在提高作物對環(huán)境脅迫抗性的分子育種中，與導入或者改良個別功能基因來提高某種抗性的傳統(tǒng)方法相比，從改良或者增強一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控能力著手，也許是提高作物抗逆性的更為有效的方法和途徑，增強一個轉(zhuǎn)錄因子的作用，就可以通過它促使多個基因發(fā)揮作用，從而是植株性狀獲得綜合改良的效果[20]。

對于廣譜抗病基因工程，盡管沒有明確的概念提出，但是目前越來越多的研究者注意到改造植物本身的防御水平和對病原菌的敏感程度可以達到提高植物抗病性的目的[21]。生產(chǎn)上向作物直接噴施水楊酸來防治病害就是一個明證。利用基因工程技術(shù)改造植物SAR發(fā)生進程也取得了許多有益的進展，例如，過量表達NPR1基因的擬南芥和轉(zhuǎn)基因高含量SA的煙草都表現(xiàn)出了不同程度的廣譜抗病結(jié)果[22]。東北農(nóng)業(yè)大學車代弟教授將NPR1基因成功轉(zhuǎn)入唐菖蒲和百合中，并獲得轉(zhuǎn)基因植株，但后續(xù)的轉(zhuǎn)基因植株的田間試驗未見報道[23-24]。

與此同時，國內(nèi)很多科研工作者注意到TGA轉(zhuǎn)錄因子家族在SAR中所起到的重要作用，多篇文獻綜述都予以大量關(guān)注，相信國內(nèi)的植物廣譜抗病育種將會逐步開展該基因的轉(zhuǎn)化和應(yīng)用工作。

4 結(jié)論

本文在國內(nèi)首次將克隆到的擬南芥TGA2轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建植物表達載體，以期轉(zhuǎn)入植物獲得廣譜抗病植株。

*孫向陽為本文的同等貢獻者。

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