鉻污染對李氏禾生理指標的影響

黃 斌，張 達，李 洋，張 霞，郝再彬,

（1.桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西 桂林 541004；2.東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

近年來,由于工業的迅猛發展，工業“三廢”的排放，使得大面積的土壤受到了重金屬的污染[1]。土壤中的重金屬可經水、大氣及生物鏈最終危害人體健康，且此類污染具有長期性、隱蔽性和不可逆性的特點，可見各種重金屬對環境的污染及破壞已嚴重危害到人們的身心健康、制約了經濟的發展，因此尋求治理此類污染的辦法迫在眉睫。近些年來，利用植物修復環境已成為污染治理研究領域的一個前沿性課題并引起了人們的廣泛重視[2]。植物修復（Phytoremediation）是利用綠色植物來轉移、容納或轉化污染物使其對環境無害[3]。植物修復的對象是重金屬、有機物或放射性元素污染的土壤及水體[4-5]。研究表明，通過植物的吸收、揮發、根濾、降解、穩定等作用，可以凈化土壤或水體中的污染物，達到凈化環境的目的，因而植物修復是一種很有潛力、正在發展的清除環境污染的綠色技術。該技術具有成本低、不破壞土壤和河流生態環境、不引起二次污染等優點[6]。

廣西北部某電鍍廠排污口發現的一種植物—李氏禾，其對鉻具高富集能力已被張學洪等證實[7]，這為鉻污染土壤的人工濕地修復技術提供了一種新的植物種類。目前，大量的研究表明，鉻脅迫對植物的生理和結構都會造成嚴重影響[8-9]，而李氏禾對鉻的耐性機理卻少有報道。本文以不同來源李氏禾為材料，通過對比不同來源李氏禾在正常以及鉻污染環境中生理生化指標的差異，分析了在一定鉻濃度脅迫下，李氏禾各項生理生化指標的變化，探討其對重金屬污染的耐受性，為篩選適于水體或土壤污染的植物修復材料提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對照組材料

本試驗選用三種李氏禾材料：采自桂林市桃花江邊的李氏禾（材料1）；采自桂林某電鍍廠廢水排污口生長的李氏禾，對鉻有極強的耐性（材料2）；利用植物組織培養法對材料2進行了擴繁的后代（材料3）。2008年4月選取長勢良好的三種材料移栽于無污染的栽培池中，為對照組，每種材料各100株，次年取材測定。

1.1.2 處理組材料

將另一栽培池的四周及底部鋪上一層塑料薄膜，模擬電鍍廠廢水排污環境，配制K2Cr2O7溶液（20 mg·L-1），與栽培土壤均勻混合后放入池中。2008年8月上旬將上述三種材料各50株移栽至池中作為處理組，使其終年生長于其中。每組對應的材料分別為材料4、材料5和材料6，定期澆灌配置好的K2Cr2O7溶液，使栽培土中Cr6+盡量保持一定濃度不變。次年取材測定。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理及各種生理指標測定

2009年10月上旬，分別取上述六種材料（各取15株）的葉片，摘取時間上午8∶00～9∶00，去離子水沖洗3次，然后105℃下殺青30 min，80℃烘干4 h，分裝后于4℃冰箱保存，用于以下測定：丙酮法測定葉綠素含量[10]，DNS（3，5-二硝基水楊酸法）比色法測定還原糖含量[10]，巴比妥酸（Barbituric acid，TBA）顯色法測定丙二醛（Malonaldehyde，MDA）含量[10]，三氯化鋁顯色法測定類黃酮含量[11]。

2009年10月上旬，分別取上述六種材料（各取15株）的葉片，摘取時間上午8∶00～9∶00，去離子水沖洗3次后，加入適量預冷的磷酸緩沖液（pH 7.8，含有1%聚乙烯吡咯烷酮）及少量石英砂于冰浴上勻漿，在4℃下離心20 min，取上清液用于以下測定：茚三酮顯色法測定脯氨酸含量[10]，考馬斯亮藍G250法測定可溶性蛋白含量[10]，氮藍四唑（Nitrogen blue tetrazolium，NBT）顯色法測超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性[10]，愈創木酚法測定過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性[10]，紫外吸收法測定過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性[10]。

1.2.2 SDS-PAGE電泳

2009年10月上旬，分別取上述六種材料的葉片，各取0.5 g，摘取時間上午8：00～9：00，用去離子水沖洗3次后，加入3 mL預冷的蛋白提取液（pH 8.0，含有1%聚乙烯吡咯烷酮和Tris-HCl緩沖液）及少量石英砂于冰浴上勻漿，靜置2 h后，于4℃下離心20 min，取上清液2 mL用于SDS-PAGE電泳。分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。上樣量均為25 μL，在室溫下進行電泳。上述試驗均為3次重復。

1.3 數據處理與分析

試驗結果用Excel軟件進行數據處理與分析。結果用平均值±標準差表示，材料之間用t-檢驗法進行比較，P＜0.05被認為有顯著差異；反之為不顯著。成對比較組別有相同環境下，材料2與1的比較；材料2與3的比較；材料5與4的比較，材料5與6的比較；不同環境中，材料1與4的比較，材料2與5的比較，材料3與6的比較。

2 結果與分析

2.1 鉻污染對李氏禾葉片葉綠素及類胡蘿卜素含量的影響

重金屬毒害植物的一個重要特征就是引起葉綠素減少、蛋白質含量降低，從而使植物失綠，產生毒害現象[12]。處理組材料的葉綠素a、葉綠素b及總葉綠素和類胡蘿卜素含量均顯著低于（P＜0.05）對照組的相應材料，說明土壤中過多的Cr6+已經在李氏禾體內產生一定的毒害作用，Cr6+可能與葉綠體中蛋白質上的巰基結合或取代其中的Fe2+、Zn2+和Mg2+，破壞了葉綠體的結構和功能[13]，從而使植物葉片內葉綠素含量有所降低（見表1）。

其次，無論是對照組還是處理組，葉綠素總量是材料1、2、3或4、5、6呈逐漸升高的趨勢；同時材料3的含量高于材料2、材料6高于材料5，差異顯著（P＜0.05）。這很可能是因為材料2在放入無污染的栽培土之前，長期生長在鉻污染的環境中，從而產生了某些耐性機制從而減少了Cr對葉綠素的傷害；在處理組中生長的材料6繼承了材料3的這一特性。由此可見，葉綠素含量有穩定遺傳的傾向。

2.2 鉻污染對李氏禾葉片還原糖、丙二醛和類黃酮含量的影響

表1 鉻脅迫下李氏禾葉片葉綠素及類胡蘿卜素含量的變化Table 1 Change of chlorophyll and carotenoid content in leaves of Leersia hexandra under Cr stress

表2 鉻脅迫下李氏禾葉片還原糖、丙二醛和類黃酮的含量的變化Table 2 Change of reducing sugars,MDA,and flavonoid content in leaves of Leersia hexandra under Cr stress(mg·g-1)

由表2可知，在處理組中生長的3個材料，其還原糖、MDA及類黃酮的含量均高于對照組的3個材料，差異較顯著（P＜0.05）。

植物葉內可溶性糖含量代表碳水化合物的運轉情況，亦可以作為生理指標之一來反映重金屬污染對作物的毒害作用[14]。處理組3個材料葉片的還原糖含量均高于對照組，差異較顯著（P＜0.05）（見表2）。說明一定濃度的鉻脅迫下可促進李氏禾葉片內可溶性糖的合成。植物在逆境中，細胞原生質膜中的不飽和脂肪酸會發生過氧化作用產生MDA，因而MDA含量可反映膜脂過氧化作用的強弱[15]。處理組3個材料葉片的MDA積累均顯著高于對照組（P＜0.05）（見表2），可能是處于一定鉻濃度脅迫下，體內產生并積累大量活性氧引發了膜脂過氧化。

處理組3個材料葉片的類黃酮化合物均顯著高于對照組（P＜0.05）（見表2）。類黃酮化合物是植物體內重要的次生代謝物，一些體外實驗也證明，類黃酮物質具有很高的抗氧化活性，具體表現為減少自由基的產生和清除自由基兩個方面，其在植物適應逆境過程中發揮重要的作用[16]。

2.3 鉻污染對李氏禾葉片脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響

脯氨酸是一種較理想的滲透調節物質，其在抗逆中的作用是作為滲透調節物質[17]，來保持原生質與環境的滲透平衡，防止水分散失，逆境下可用作反映植物抗逆性的參考性生理指標[18]。在抗逆中脯氨酸還有保持膜結構的完整性的作用[19]，如果植物體內蛋白質的合成受阻，會抑制脯氨酸摻入蛋白質而造成脯氨酸的大量積累[20]。處理組的3個材料，其葉片的脯氨酸含量均顯著低于對照組（P＜0.05）；而可溶性蛋白含量均顯著高于對照組（P＜0.05）（見表3），說明在一定鉻濃度的脅迫下3個材料體內蛋白質的合成受到一定程度的刺激。

表3 鉻脅迫下李氏禾葉片脯氨酸和可溶性蛋白含量的變化Table 3 Change of proline and soluble protein content in leaves of Leersia hexandra under Cr stress

2.4 鉻污染對李氏禾葉片SOD、POD和CAT活性的影響

由表4可知，處理組3個材料的SOD和POD酶活性顯著低于對照組（P＜0.05）；而CAT酶活性則顯著高于對照組（P＜0.05）。說明一定鉻濃度的脅迫下，李氏禾體內多種功能膜及酶系統均受到一定程度的破壞，造成SOD及POD活性有所下降；但其體內的CAT活性受到一定的刺激作用而有所的增加，可清除細胞內過量的H2O2，使植物能適應鉻的污染。

圖1 鉻脅迫下李氏禾葉片的SDS-PAGE電泳Fig.1 SDS-PAGE in leaves of Leersia hexandra under Cr stress

由圖1可知，3個材料在對照組和處理組中無表達差異的蛋白條帶出現，且分子質量為64.6、52.5、47.7和30.2 ku的多肽在圖譜中的表達量較明顯。說明一定濃度的鉻脅迫對李氏禾的蛋白組分沒有明顯影響；但處理組的蛋白條帶亮度明顯比對照組強，與表3中的可溶性蛋白含量的增加相一致。

3 討論

葉綠體是植物細胞所特有的能量轉換細胞器，它受重金屬的影響也比較明顯[9]，且葉綠素減少、蛋白質含量降低是植物受到重金屬毒害一個重要特征。本試驗發現，與正常環境相比，在一定濃度的鉻脅迫下，李氏禾體內葉綠素含量的減少，這是由于其葉綠體的結構和功能均受到一定程度的破壞，從而使植物體內葉綠素含量有所降低。但通過比較兩種環境下可溶性蛋白含量的差異，發現在一定鉻濃度脅迫下李氏禾體內蛋白質含量有所增加，可能水溶性蛋白質與鉻以某種形式結合進而降低了鉻對細胞的傷害；而脯氨酸含量則有所降低，可能由于部分脯氨酸參與了水溶性蛋白質的合成，說明李氏禾為適應在鉻污染環境下生長而進行了一些生理調節。

在鉻污染環境中生長的三種材料，其還原糖、MDA及類黃酮的含量均高于在對照組正常環境生長的三種材料，其原因為李氏禾體內鉻過多的積累，不僅破壞了其體內活性氧產生和清除的平衡，造成MDA的大量積累，而且過多的自由基，刺激其體內產生了大量的類黃酮化合物，以達到抑制產生自由基過多的目的。

植物體內活性氧自由基的危害集中體現于其對膜脂的過氧化作用，造成膜脫脂并引起膜滲漏。眾多研究證明POD、SOD和CAT是植物體內酶促防御系統的3個重要保護酶，彼此協同起來可以解除細胞內有害的自由基[21]，保護植物細胞免受活性氧的損傷。SOD是超氧自由基清除劑，在逆境脅迫下，當植株體內超氧自由基的增加超過正常歧化能力的極限時，會對組織細胞多種功能膜及酶系統造成破壞，使SOD活性急劇或緩慢下降[12]；POD在清除植物體內產生的有毒物質中有重要意義[22-23]，可用來鑒別環境污染對植物的毒害[24]；CAT能夠清除細胞內過多的H2O2，使細胞內H2O2維持在一個正常水平，保護細胞膜結構[25]。在一定鉻濃度污染環境中，三種材料的SOD和POD活性有所下降，CAT有所增強，說明其體內多種功能膜及酶系統均受到一定程度的破壞，但是CAT活性的增強可一定程度上阻止破壞的繼續，并協同SOD和POD解除細胞內有害的自由基，在一定程度上使李氏禾適應鉻污染的環境。

SDS-PAGE分析顯示，兩種環境下三種材料均無差異蛋白條帶出現，說明一定鉻濃度脅迫下，李氏禾體內的蛋白組分未受到影響而發生改變。

4 結論

李氏禾在一定鉻濃度脅迫的環境中其葉片的葉綠素、可溶性糖、MDA、類黃酮化合物、脯氨酸、可溶性蛋白含量和保護酶SOD、POD、CAT活性能適應鉻脅迫并作出相應的調節，從而維持植株良好生長。鉻耐性的組培后代李氏禾（材料3、6）在兩種環境中的各項生理指標較鉻耐性材料（材料2、5）均有較顯著的提高。李氏禾可以作為一種具潛力的環境修復植物。

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