甜菜亞硝酸還原酶（NiR）基因的克隆與分析

曾彥達，石曉艷，馬鳳鳴

（東北農業大學農學院，哈爾濱 150030）

亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR）是植物硝態氮同化過程中一個十分重要的酶，其與硝酸還原酶（Nitrate reductase，NR）偶聯完成NO3-的無機同化[1]，該酶催化NO2-還原為NH4+，以NADPH為電子供體在白色體中完成，在硝酸鹽降解生成銨這一過程中起到承前啟后的作用。NiR是植物體中NO2-同化過程的控制酶，其基因與NR都受NO3-的調節表達有關[2]；Faure等研究發現，在白化煙葉片中的NR和NiR轉錄同時積累，當低水平的NR活性恢復后，NiR的活性水平也恢復正常，并把這種表達過程中的NR與NiR的相互作用稱為NR和NiR的偶聯調節[3]。目前，與NR相比較，有關NiR研究尚少。

NiR基因結構的研究始于上個世紀80年代末期，Lahners等提出了玉米NiR分子結構[4]。繼后，在菠菜、水稻、煙草、擬南芥等高等植物中已克隆了NiR的基因[5-7]，在甜菜上鮮有報道而且研究并不詳細。本研究克隆了甜菜亞硝酸還原酶基因，對其核苷酸和氨基酸序列以及蛋白結構進行了分析，有利于研究清楚甜菜這一特定作物編碼NiR的基因及其表達和調控問題，可為植物營養與分子生理學填補基礎性資料；為改造基因和基因操作奠定基礎，尤其是研究由環境條件引起的mRNA和特異蛋白質差異變化，將對甜菜NiR基因操作表達及表達時環境條件影響的機制提供分子生物學的解釋；為全面分析NR和NiR的偶聯作用提供分子生物學理論基礎，有助于研究制定更為合理的施肥措施，培育甜菜氮高效利用品種，降低施肥費用，提高種植甜菜的經濟效益，改善和防止因過量施肥所導致硝酸鹽和亞硝酸鹽積累造成的生態污染。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用甜菜品種為甜研7號，種子在室溫下浸種12 h，然后置于培養皿中25℃恒溫培養24～48 h，移栽于培養缽中，待幼苗長至4～6片葉后，剪取完全伸展的幼苗葉片，提取總RNA和基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取

參照Trizol的說明書方法提取總RNA，電泳后通過凝膠成像系統進行觀察和拍照。選擇完整性好，質量高的RNA進行下一步試驗。

1.2.2 甜菜NiR基因cDNA全長的克隆

使用寶生物公司的RACE試劑盒克隆基因的末端序列。參照NCBI上甜菜NiR基因cDNA的部分序列（登陸號：AF173663），以及菠菜、大豆NiR序列保守區分別設計3′/5′特異引物。設計兩條正向嵌套引物3′-RACE Outer SP和3′-RACE inner SP，3′-RACE Outer SP與試劑盒引物3′Outer primer進行第一輪PCR反應，產物稀釋5倍作為模板，3′-RACE Inner SP 與3′Inner primer進行第二輪巢式PCR擴增。設計5′端特異反轉錄引物5′-RACE Outer AP 和5′-RACE Inner AP，5′-RACE Outer AP與5′Outer primer進行第一輪PCR反應，產物直接作為模板，5′-RACE Inner AP和5′Inner primer進行第二輪巢式擴增。將已知的中間序列與3′端和5′端序列拼接后得到基因全長。克隆甜菜NiR基因引物見表1，所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR擴增的特異片段按照寶生物膠回收試劑盒的使用說明進行回收。回收的目的片段連接到pMD19-T載體（TaKaRa）。連接產物轉化感受態大腸桿菌JM109（TaKaRa），進行藍白斑篩選，挑取白色菌落，使用菌落PCR法確認載體中插入片段的長度大小；將白斑接種于LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。取陽性克隆菌液由上海生物工程公司測序。根據所得甜菜NiR基因的末端序列設計引物（見表1）進行PCR，克隆NiR基因cDNA序列全長。

表1 甜菜NiR基因特異引物Table 1 Primers for cloning of sugar beet NiR gene

1.2.3 甜菜NiR基因組DNA（gDNA）的克隆

依據NiRcDNA全長序列，設計引物，進行PCR擴增NiRgDNA的全長序列。PCR擴增條件：94℃ 1 min，94℃ 30 s，57℃ 1 min，72℃ 3 min，30個循環，72℃10 min，4℃保存。PCR擴增的特異片段按照寶生物膠回收試劑盒的使用說明進行回收。回收的目的片段連接到pMD19-T載體（TaKaRa）。連接產物轉化感受態大腸桿菌JM109（TaKaRa），進行藍白斑篩選，挑取白色菌落，使用菌落PCR法確認載體中插入片段的長度大小；將白斑接種于LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。取陽性克隆菌液由上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.4 序列分析

測序得到的NiRcDNA序列利用NCBI網站提供的ORF Finder找出基因的讀碼框，然后利用瑞士生物信息學研究所提供的ProtParam等網站進行氨基酸殘基數目、組成、蛋白質相對分子質量、理論等電點、平均疏水性及三維結構等參數在線分析[8-9]。

2 結果與分析

2.1 甜菜NiR cDNA序列的克隆

以甜菜總RNA為模板，根據甜菜NiRcDNA已知的中間片段設計了3′/5′RACE的引物，分別經過兩輪巢式PCR擴增，得到了一條約1 640 bp和一條約437 bp左右的條帶，與預期片段大小基本相符。將兩片段克隆，測序后發現，克隆所得片段與中間片段都具有重疊區，且含有poly（A）結構。同時將中間片段和RACE產物的拼接序列設計特異引物cDNA全長SP和cDNA全長AP，進行PCR擴增得到序列對比拼接序列，發現二者相同。再將該序列進入NCBI比對，結果顯示全序列與同為藜科植物的菠菜NiR序列相似度達到了83%，表明所克隆的片段正是甜菜NiR的3′末端和5′末端序列。結果表明，該cDNA全長為2 014 bp，含有1 830 bp的完整開放閱讀框，編碼599個氨基酸的蛋白質，登錄號為HQ224499（見圖1）。

圖1 甜菜NiR cDNA擴增Fig.1 Amplification of sugar beet NiR cDNA

2.2 甜菜NiR gDNA序列的克隆

以甜菜總DNA為模板，根據已克隆甜菜NiRcDNA序列設計特異引物gDNA全長SP和gDNA全長AP，通過PCR擴增得到甜菜NiRgDNA編碼序列，登錄號為HQ419065，總長度為2 815 bp，含有4個外顯子和有3個內含子，內含子長度分別為532、136、270 bp（見圖2）。

圖2 甜菜NiR gDNA擴增Fig.2 Amplification of sugar beet NiR gDNA

2.3 序列分析

2.3.1 不同植物NiR蛋白分子進化樹分析

在BLASTp分析的基礎上[10-11]，選擇與其同源性較高的幾條序列做N-J聚類分析，以期對Ty7 NiR蛋白和其他NiR蛋白的同源性做進一步分析。用Clustalx軟件將NiR的氨基酸序列進行多重序列比對，然后將生成的系統發育樹做N-J聚類分析（見圖3）。

NiR進化樹分析表明，甜菜與藜科植物NiR親緣關系較近，與其他植物存在一定差別。在該進化樹中同科植物表現比較近的親緣關系，如豆科的大豆（Glycine max）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、百脈根（Lotus japonicus）、茄科的煙草（Nicotiana tabacum）、甜椒（Capsicum annuum）、喬木科的小麥（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）。推測NiR在進化過程中的變異不大，有較強的保守性。使用在線軟件Pfam分析NiR蛋白的保守序列，結果表明，NiR序列在133～598位氨基酸之間保守性很強。

圖3 甜菜NiR蛋白的分子進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of sugar beet NiR proteins

2.3.2 甜菜NiR基因編碼蛋白一級結構分析

甜菜NiR cDNA序列通過ORF finder分析，可得到完整的ORF位于核酸序列的32～1 831區域，編碼蛋白包含599個氨基酸殘基，分子質量為66.88 ku（Expasy protparam），理論等電點為7.21。酸性氨基酸殘基總數（Asp+Glu）78個，堿性氨基酸殘基總數（Arg+Lys）78個。分子式為C2938H4716N848O873S31，總原子數為9 406。根據所編碼蛋白質的一級序列進行疏水性作圖（見圖4），疏水性較高的肽段處于蛋白質內部，反之，親水性較高的肽段處于蛋白質分子的表面。

甜菜NiR的平均疏水性分析顯示約有10個峰值，表明該肽段約有10個疏水區域。使用在線分析軟件SignalP對甜菜NiR進行信號肽的分析，得知甜菜NiR無典型的信號肽分值，無信號肽，為非分泌型蛋白。

圖4 甜菜NiR編碼蛋白的疏水性分析Fig.4 Hydrophobicity profile of sugar beet NiR

2.3.3 甜菜NiR基因編碼蛋白二級結構預測

利用ExPASy的GOR進行二級結構預測（見圖5），h代表α螺旋，e代表延伸鏈，c代表無規則卷曲。α螺旋、延伸鏈、無規則卷曲分別占29.05%、21.04%和49.92%。

2.3.4 甜菜NiR基因編碼蛋白立體結構預測

將所推測的甜菜NiR蛋白序列提交至ExPASy Geno3d，選取程序搜索到的第一個模板，以這一蛋白結構作為模板進行Geno3d建模。Geno3d建模如圖6所示，其中包括24個α螺旋和57個轉角。

圖5 GOR法預測蛋白質的二級結構Fig.5 Secondary structures of protein predicted by GOR method

圖6 用Geno3d預測的甜菜NiR三維結構Fig.6 Tertiary structure of NiR protein predicted by Geno3d

3 討論

硝態氮（NO3-）是旱田作物可利用氮素的主要形式，NR是NO3-無機同化的限速酶，NiR是NO3-無機同化的控制酶。二者偶聯完成NO3-的無機同化。與NR相比較，有關NiR研究尚少。本研究首次克隆了甜菜亞硝酸還原酶基因，有助于后續研究NiR與NR的偶聯調節，及偶聯作用下與甜菜蔗糖代謝積累的相互關系，可為種質資源鑒定、基因操作培育氮高效利用品種提供分子生物學理論依據；可從分子水平上闡明外界因子的調節作用，提高氮的轉化效率，為制定施肥措施服務；同時對防止與改善農業施肥中硝酸鹽及其轉化過程中給地下水帶來的嚴重污染具有重要科學意義。

4 結論

本研究以甜菜甜研7號為材料，通過簡并PCR和RACE方法克隆了甜菜亞硝酸還原酶cDNA和gDNA基因；利用生物信息學手段進行NiR基因的結構及其理化特化分析。得到結論如下：

a.從甜菜中獲得了NiR基因mRNA和gDNA序列，其中mRNA序列長度為2 014 bp（登陸號：HQ224499），可編碼一個含有599個氨基酸，gDNA序列長度為2 815 bp（登陸號：HQ419065），包含4個外顯子和3個內含子。

b.分析了NiR的理化特征，得到NiR的理論等電點為7.21，分子式為C2938H4716N848O873S31，蛋白質相對分子質量為66.88 ku，對NiR進行疏水性分析，顯示該肽段有約10個疏水區域。

c.二級結構預測結果顯示，NiR的α螺旋、延伸鏈、無規則卷曲分別占33.89%、12.85%和53.26%。三維結構預測結果顯示，NiR蛋白包括24個α螺旋和57個轉角。

d.構建了NiR的進化樹，結果表明甜菜NiR與菠菜親緣關系最近，在進化中相對保守。運用分析軟件Pfam分析甜菜NiR氨基酸序列，顯示甜菜NiR包含一個保守區域，存在于133～598位氨基酸之間。

e.運用在線分析軟件SignalP對甜菜NiR進行信號肽的分析，得知甜菜NiR無典型的信號肽分值，無信號肽，為非分泌型蛋白。

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