觀賞植物多倍體誘導研究進展

雷家軍,王 沖

（沈陽農業大學園藝學院，沈陽 110866）

1 植物多倍體的特點及其應用

自然界中植物普遍存在多倍體現象，被子植物中約30%～35%是多倍體，其中禾本科植物中70%為多倍體。多倍體是植物最主要的進化方式之一。多倍體育種由于其誘變手段較簡單，育出的品種經濟價值高，還可有效克服遠緣雜交不親和等特點，因此應用較為廣泛。植物多倍體的“巨大性”非常明顯[1]。多倍體植株通常花冠大而厚實，花瓣較多，花色變深，莖變粗壯，耐倒伏，葉片變寬厚，適應性增強，光合作用增強。目前，美國、日本等都已通過人工誘導多倍體手段育成一批具有較高觀賞價值的花卉品種。到目前為止，許多觀賞植物已人工誘導獲得了多倍體（見表1），部分已在生產中得到應用。

表1 已誘導獲得多倍體的主要觀賞植物科、屬及種類（1980～2010）Table 1 Family,genus and species of main ornamental plants induced polyploid successfully from 1980 to 2010

2 多倍體的誘導

2.1 誘變材料的選擇

離體培養的材料一般是種子、幼苗、生長點、莖尖、愈傷組織、胚狀體、懸浮細胞系、小孢子、原生質體或單細胞等，誘變材料選取植株或組織分裂最旺盛的時期和部位。誘變材料在很大程度上決定著誘變的效率。雷家軍等采用秋水仙素對草莓種子和莖尖進行離體誘導獲得大量加倍株系[45]。李涵等用秋水仙素對二倍體齒瓣石斛試管叢生芽進行誘導獲得了四倍體植株[32]。崔廣榮等用秋水仙素對蝴蝶蘭試管苗離體葉片進行誘變處理獲得了四倍體植株[31]。李秀蘭等通過秋石斛種子非共生萌發與原球莖誘導，在原球莖發育的原胚期，用混合誘變劑獲得了多倍體植株，且未發現嵌合體[33]。

2.2 誘變劑種類選擇

2.2.1 秋水仙素

自Blackes lee和Avery等用秋水仙素成功誘導出了四倍體曼陀羅以來，秋水仙素已成為誘導植物多倍體最常用的誘變劑。適宜濃度的秋水仙素能有效阻礙紡綞絲的形成而仍然保持細胞的活性，但胞質不分離而導致染色體數目加倍。在一定濃度范圍內，秋水仙素對染色體的結構無破壞作用，處理一定時間的細胞可在藥劑去除后恢復正常分裂。秋水仙素只有處理細胞分裂活躍狀態的組織才可以使分生組織的染色體加倍。

2.2.2 除草劑

秋水仙素誘導加倍最為廣泛，但秋水仙素有劇毒，因此人們一直在嘗試使用其他誘變劑。最近發現的甲基氨草磷（APM）、戊炔草胺、安磺靈（Oryzalin）、氟樂靈（Trifluralin）等除草劑在誘導染色體加倍中具有很大的潛力，它們的作用機理和秋水仙素一樣[46]。黃權軍等采用4種抗微管物質誘導毛新楊2n花粉，結果表明4種誘變劑均可誘導2n花粉，但戊炔草胺的效果最佳[47]。van Tuyl等用安磺靈取代秋水仙素對百合屬和尼潤屬植物進行染色體加倍誘導效果較好，可有效代替秋水仙素[22]。Zlesak等用0.086%氟樂靈對微型月季多倍體誘導效果最佳[39]。Dhooghe等采用三種誘變劑對花毛茛進行離體多倍體誘導，發現2 μmol·L-1氟樂靈處理后多倍體誘變率最高，達27.5%；1 μmol·L-1安磺靈也能得到較高的誘變率；200 μmol·L-1秋水仙素處理后得到23.3%的多倍體植株[38]。由此可知，除草劑與秋水仙素相比，其濃度低、毒性小、效果好，是一種有潛力的染色體加倍誘變劑。

2.2.3 其他輔助劑

在植物多倍體的化學誘導過程中，添加二甲基亞砜（DMSO）、甘油等輔助劑對提高染色體加倍效果有一定作用。二甲基亞砜是較好的滲透劑和增效劑，添加濃度一般為2%～4%。劉亞娟等在秋水仙素誘導新鐵炮百合多倍體的過程中，添加2%DMSO能顯著提高四倍體的誘導率[48]。Thao等用秋水仙素和安磺靈對處理二倍體海芋根尖時，添加1%DMSO得到了大量四倍體和嵌合體植株[5]。

2.3 誘變處理濃度和處理時間

秋水仙素濃度和處理時間共同影響染色體加倍效果，通常秋水仙素的有效濃度為0.005%～2.0%，一般范圍在0.01%～1.0%，而以0.2%～0.4%應用最廣泛。對于觀賞植物來說，木本類一般多采用較高濃度（如1.0%～1.5%），草本類多采用低濃度（如0.01%～0.2%）。一般來說，濃度越高，處理時間就越短；高濃度、長時間處理對誘變材料傷害嚴重。處理濃度、處理時間和誘導方法之間是相互關聯的。低濃度、長時間的處理多采用固體培養基誘導法，而高濃度、短時間的處理多采用溶液浸漬法。

鄭思鄉等用不同濃度秋水仙素對三色堇實生苗處理不同時間，以0.1%～0.2%秋水仙素處理12～36 h為佳，誘變率可達到26%，將嵌合體變異株去除頂端優勢促發大量的分枝或叢生芽，通過反復分割可分離出穩定的多倍體[44]。張志勝等利用秋水仙素離體誘導紅掌愈傷組織表明，在0.05%～0.10%內，低濃度長時間處理時四倍體誘導率高，高濃度短時間處理其誘導率低[7]。李涵等低濃度（0.02%）短時間（24 h）誘導非洲菊兩個品種沒有得到加倍植株，在0.10%濃度下處理48 h時，誘變率達10%～16%[12]。

2.4 離體培養誘導多倍體的方法

2.4.1 組織培養結合化學誘變

近年來，組織培養技術和化學誘導法相結合的離體培養誘導法已成為一種最常用的染色體加倍方法[49]。利用秋水仙素處理組織培養過程中的叢生芽、原球莖、體細胞胚、種子萌發幼苗等是誘導觀賞植物多倍體的有效方法。處理方法是將秋水仙素直接加入培養基中進行培養，或先對植物材料進行秋水仙素處理再放到培養基中進行培養。一般來說，直接處理外植體會產生較大藥害。目前，秋水仙素結合組織培養離體誘導加倍，已在百合、大巖桐、馬蹄蓮、虞美人等多種花卉上取得成功。

2.4.2 胚乳培養

獲得三倍體的傳統方法是將經秋水仙素誘導的四倍體與二倍體雜交，此法過程較長且煩瑣。胚乳是天然的三倍體組織，因此，胚乳培養可獲得三倍體植株，如獼猴桃[50]、白桑[51]等。吳清等以紅楊桃成熟干種子為材料，萌發后剝離胚乳進行培養，再生植株多數為三倍體，其頻率可達73.7%[52]。胚乳培養目前主要應用在果樹、蔬菜、水果和糧食作物中，花卉中應用較少，在生產上應用也很少，其難點在于被子植物胚乳離體培養通常很難誘導和分化出苗。此外，胚乳愈傷組織在繼代培養中染色體數目不穩定，再生植株多為非整倍體、混倍體。

2.4.3 原生質體融合

原生質體融合是把種內、種間或屬間的原生質體融合后再誘導分化成再生植株。體細胞間融合和體-配融合的結果是分別產生四倍體細胞和三倍體細胞，經過進一步培養可形成四倍體和三倍體植株。劉繼紅等用電場誘導融合丹西紅橘和長壽金柑的葉肉原生質體，獲得四倍體再生植株[53]。利用細胞融合技術不僅能自體融合單倍體或二倍體花粉，在短期內獲得純合四倍體，還能異體融合野生種與栽培種，產生四倍體雜種，快速實現野生種的優良抗性或品質基因向栽培種轉移。此外，細胞融合法還可有效克服植物遠緣雜交障礙。

2.4.4 2n配子法

2n配子即未減數配子，它是與體細胞的染色體數目相同的花粉或卵細胞。通過單向多倍化（雙親之一產生2n配子）或雙向多倍化（雙親均能產生2n配子）均能提高雜交后代的倍性水平。2n配子法雖然在馬鈴薯、果樹、牧草等作物上早已研究，但在花卉方面國內外報道還很少，目前僅在百合[21]、秋海棠[9]、郁金香[25]、鶴望蘭[43]等花卉上獲得了2n配子。

2.4.5 其他誘導方法

常用的物理方法有溫度激變、電離輻射、機械創傷、滲透壓改變、超聲波和摘心等，但這些方法誘變率低，因而較少應用。花卉中已在月季、蘭花、菊花、大麗花等應用輻射進行誘變育種，發現可在花色、花型、株型上出現有利的變異。

3 多倍體的鑒定

3.1 染色體數目鑒定

根尖染色體數目鑒定是最直接、最有效的倍性鑒定方法。通常采用常規壓片法和去壁低滲法進行觀察[54]。陳高等考慮到七里香染色體數目較多、不宜計數及壓片過程中可能出現染色體斷裂、重疊或丟失等，對處理后出現染色體變動的情況做如下處理：二倍體的染色體數目2n=2x=38±2，四倍體的染色體數目2n=4x=76±4，即誤差范圍控制在10%以內，這樣便于更快速確定倍性[55]。

3.2 形態學鑒定

形態學鑒定是最直觀、最簡單的鑒定法，從幼苗到大苗各期，都可以從形態上觀察。通常在秋水仙素早期處理過程中，生長明顯受到抑制，生根較晚，且根短而粗壯。經染色體加倍后的多倍體植株，常表現出植株生長緩慢、發育遲緩、物候期晚。崔廣榮等誘導的蝴蝶蘭多倍體苗在形態上與二倍體差異顯著，普通二倍體植株葉片表面平滑，葉片較薄、松散，根相對細長且數量較多；秋水仙素誘導的多倍體試管苗，則葉片緊湊、植株變矮，表現出一定的畸形狀態，葉片上下表面粗糙不平，葉片厚實，根粗短且數量相對較少[31]。鄭寶強等發現與春石斛二倍體相比，四倍體植株頂芽和側芽膨大成球狀，假鱗莖變粗，下層葉片多呈畸形，葉寬、短而厚，葉色濃綠，葉表面粗糙，葉脆易折斷[56]。

3.3 生理指標鑒定

染色體加倍后，一些生理指標如滲透壓、呼吸作用、光合速率、蒸騰速率、同工酶及酶譜變化、糖含量、維生素含量、礦物質含量、氨基酸含量等也發生相應變化，可作為間接鑒定植物倍性的依據。鄭思鄉等發現，三色堇四倍體植株的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度均比二倍體植株高，特別是凈光合速率比二倍體高47.8%[44]。王鴻鶴等發現經秋水仙素處理的大巖桐四倍體與二倍體的過氧化物酶酶譜差異明顯，還發現多出兩條特征性譜帶[17]。

3.4 細胞學鑒定

3.4.1 氣孔、保衛細胞大小和葉綠體數目

多倍體植株的氣孔和保衛細胞變大、保衛細胞的葉綠體數目增多。陳發棣等觀察發現多倍體菊花腦的保衛細胞的長與寬均顯著大于對照植株，葉綠體數目也遠遠超過對照植株[13]。閻志紅等采用FDA熒光鑒定法發現四倍體西瓜的保衛細胞葉綠體數目增加，每對保衛細胞的葉綠體數由8個增加到15個[57]。

3.4.2 花粉形態及花粉母細胞減數分裂行為

多倍體較二倍體花粉粒萌發孔溝數目增多，花粉粒大小不整齊，敗育花粉粒較多，小孢子母細胞增大，在減數分裂中有異常行為。蔣洪恩等發現二倍體臨猗梨棗和辣椒棗的花粉粒體積較小，多為3個或2個萌發孔溝；四倍體花粉粒體積顯著增大，并出現了一定數量的4孔溝花粉，同時存在大量畸形花粉，花粉活力顯著降低[58]。張敩方等發現四倍體金魚草花粉母細胞減數分裂過程與二倍體對照相比，主要有以下幾點不同：染色體配對較復雜；染色體在后期I和后期II的分離過程中落后染色體多；花粉全部敗育，花開放時花粉全部粘滯在一起，花藥多呈肉質化或發霉爛掉[41]。

3.5 分子水平鑒定

流式細胞計數法可迅速測定細胞核內DNA含量和細胞核大小，是大量試材快速鑒定倍性的有效方法，此方法僅需1 cm2樣品就可測定其材料倍性[59]，但其穩定性和準確性還有待提高。Roberts等用此方法測定薔薇DNA含量來判斷加倍植株的倍性水平[40]。此外，原位雜交（GISH、FISH）、RAPD、RFLP等技術也廣泛應用到多倍體來源及親緣關系的鑒定中[60]。

4 多倍體誘導中存在的主要問題

4.1 嵌合體的篩選

在誘導植物多倍體時，出現嵌合體是一種較常見現象。近年來隨著組織培養技術與多倍體育種技術相結合，嵌合體的問題正逐步得到解決。李曉艷等對秋水仙素離體誘導越橘多倍體的根尖染色體進行觀察，發現變異株系多為二倍體和四倍體的嵌合體[61]。嵌合體的變異細胞往往發生在L-Ⅰ層或L-II層，或呈扇形突變。產生的變異細胞往往生活力弱，分裂速度慢；而正常二倍體細胞生活力強，分裂快，從而淹沒變異細胞，表現為回復突變。李涵等對齒瓣石斛的變異植株，采用不定芽技術結合組織培養，通過不斷切割多倍體莖、葉等材料，再培養產生新的個體，純化為完全多倍體，通過該方法已得到了部分相對穩定的植株材料[32]。

4.2 多倍體的低稔性

盡管多倍體具有較多優勢，但由正常開花結實的二倍體加倍成四倍體后，其稔性明顯降低，結實性很差，種間雜種五倍體加倍成十倍體后則稔性明顯提高。目前，多倍體有性生殖的遺傳機理仍不十分清楚，人們一直在運用遺傳學、胚胎學和分子生物學等手段探明多倍性植株結實率低和種子不飽滿的機理。譚素英等以西瓜四倍體和二倍體為試材，從授粉受精和胚胎發育的角度研究認為，花粉萌發率低、胚囊受精率低、胚乳過早解體、大多數胚在發育過程中敗育是造成低稔性的原因[62]。很多試驗證明，增施磷、鉀、鎂、硼等肥料可促進同化物質的運轉，從而提高稔性。

*本文為特邀專家綜述。

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