云南野生大紅菇多糖水提法工藝研究*

趙 靚，趙天瑞，樊 建

（昆明理工大學化學工程學院，云南 昆明 650224）

多糖具有抗氧化、增強免疫力、抗腫瘤、抗衰老等生理功能，并且食用菌多糖由于其分子結構與人的細胞膜多糖體結構類似[1]，對正常細胞無毒害作用，因而可以作為理想的免疫調節劑使用[2]。研究表明，香菇、云芝等野生食用菌多糖都能夠提高NK細胞、細胞毒性T淋巴細胞（CTL）及遲發型超敏反應（DTH）對腫瘤細胞的反應[3]。大紅菇（Russula alutacea Fr.）屬于真菌類、擔子菌綱、傘菌目、紅菇科，其子實體一般較大，菌蓋直徑6 cm～16 cm，呈深莧菜紅色、鮮紫紅或暗紫紅色，邊緣平滑或有不明顯條紋。菌肉白色，味道柔和。菌褶為乳白色后淡赭黃色，前緣常常帶紅色。菌柄為白色近圓柱形，長3.5 cm～13 cm，粗1.5 cm～3.5 cm。我國主要分布于云南、福建、遼寧、江蘇、江西、廣西、四川等地，而在云南，大紅菇主要分布在昆明、麗江、大理、楚雄、思茅等地。紅菇的盛產期為每年降雨量較多、相對濕度較大的夏秋季節[4]。大紅菇性微溫，不僅美味而且具有很高的營養價值。目前，對紅菇屬的研究報道主要有福建等地的正紅菇[5，6]等，而對云南野生大紅菇子實體多糖的研究鮮見報道。本文以云南野生大紅菇子實體為原料，研究水法提取大紅菇多糖的工藝條件，為該多糖的分離、純化及性質研究等奠定堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：大紅菇購自云南省麗江市，經昆明食用菌研究所劉蓓研究員鑒定確認。

試劑：苯酚、硫酸、95%乙醇、D-葡萄糖、85%磷酸等均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的制備

準確稱取無水葡萄糖0.1000 g于100 mL容量瓶中定容，制得1 mg·mL-1的葡萄糖標準溶液，搖勻備用。

1.2.2 標準曲線的繪制

用移液管分別吸取葡萄糖標準溶液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，置于50 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。再分別吸取上述溶液0.8 mL置于20 mL試管中，以蒸餾水為空白對照，每個試管中加入新配制的5%的苯酚溶液0.8 mL，然后迅速加入濃硫酸5 mL，混合均勻后沸水浴30 min，室溫下冷卻。于490 nm波長處測定吸光度A，繪制標準曲線（圖1），得回歸方程[7]。

圖1 葡萄糖標準曲線

1.2.3 樣品測定

使用高速粉碎機粉碎大紅菇子實體，粉末過60目篩，未篩過部分利用研缽磨碎直至全部過篩。粉末經低溫烘干后準確稱取0.25 g，按設定提取溫度、時間和料液比提取多糖，過濾定容至500 mL得到樣品溶液A。精確吸取樣品溶液A約0.8 mL，按1.2.2所述方法操作，將所測得的樣品液的吸光值帶入回歸方程中，計算出多糖產量從而得到大紅菇多糖提取率（P），公式如下：

而最早的期貨發源于農產品交易，農民和買糧的商人為防止未來因糧食豐歉而導致糧價漲跌，而預先商定未來的糧價，即通過提前交易鎖定價格風險，這就是期貨的雛形。此后，市場又發明了標準合約和保證金制度。1848年美國芝加哥期貨交易所（CBOT）的建立，標志著現代期貨時代的開始。

式中：m為多糖產量；M為大紅菇原料干重。

1.2.4 單因素試驗

在其他條件都相同的情況下，分別考慮溫度（60℃、70℃、 80℃、 90℃、 100℃）、 提取時間（1 h、 2 h、3 h、4 h、 5 h、 6 h、 7 h）、 水料比（10∶1、 20∶1、 30∶1、 40∶1、 50∶1、 60∶1、 70∶1） 等對多糖提取率的影響。

1.2.5 響應曲面法試驗設計

在單因素試驗的基礎上，每種因素各選出3個水平進行響應面試驗，進行多糖水提法的最佳工藝條件研究。利用Design Expert 7.1軟件，采用中心組合試驗Box-Benhnken設計方案。試驗因素水平編碼見表1。

表1 試驗方案因素水平編碼值表

以多糖提取率為響應值（Y），設計了3因素3水平的響應分析試驗。共有15個試驗點，其中包括12個析因點和3個中心點。

2 結果與討論

2.1 單因素對大紅菇多糖提取的影響

2.1.1 提取溫度對多糖提取率的影響

以水料比為 40∶1（mL∶g）、 提取時間為 4 h，提取溫度分別為60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，提取2次，分別測定多糖含量，結果如圖2所示。

圖2 提取溫度對多糖提取率的影響

由圖2可知，在60℃～90℃溫度范圍內多糖提取率隨溫度的升高明顯增大，超過90℃以后其提取率反而降低。出現這一現象的原因可能是溫度過高致使提取液中的樣品掛壁，不能充分與提取液接觸，減少了多糖的溶出。實驗證明90℃左右為大紅菇多糖水提取的較優溫度，而其它食用菌多糖的最佳水提溫度也在90℃附近[8，9]。因此選取90℃為響應曲面設計溫度因素3個水平中的中間值。

2.1.2 提取時間對多糖提取率的影響

確定水料比為 40∶1（mL∶g），提取溫度為 90℃，提取時間分別為 1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h，提取 2次。分別測定大紅菇多糖含量，結果如圖3所示。

從圖3可以看出，在1 h～5 h內多糖提取率隨著時間的延長而明顯提高，5 h時提取率達到最高值，為7.3945%，而5 h之后多糖提取率出現下降， 6 h的提取率比5 h下將0.6575%，說明5 h時多糖浸出已經比較完全，時間過長反而不利于提取，并且增加耗能，所以選取5 h為響應曲面設計中時間因素3個水平的中間值。

圖3 提取時間對多糖提取率的影響

2.1.3 水料比對多糖提取率的影響

確定提取溫度為90℃，提取時間為5 h，設定水料比（mL∶g） 分別為 10∶1、 20∶1、 30∶1、 40∶1、 50∶1、 60∶1、 70∶1，提取2次，分別測定多糖含量，結果如圖4所示。

圖4 水料比對多糖提取率的影響

由圖4可以看出，當水料比為10∶1～50∶1時，多糖提取率隨水料比的增加十分明顯，在水料比為50∶1時提取率達到最高，而當水料比繼續增加時多糖提取率變化并不明顯，因此估計當水料比為50∶1時已能將大紅菇多糖充分溶出。水料比較小不利于原料中多糖的溶出，而水料比過高不僅會增大試劑的消耗量，而且不利于后期的分離濃縮。綜合考慮產品得率、試劑消耗及后續處理，選取50∶1（mL∶g）為響應曲面優化設計中水料比因素的中間水平。

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面試驗方案及結果

以X1、X2、X3為自變量，以多糖提取率為響應值Y，響應面試驗設計方案及結果如表2所示。

2.2.2 響應面試驗結果方差分析

利用Design Expert 7.1軟件對響應值進行回歸分析，經回歸擬合后，各因子與響應值的回歸方程為：Y＝7.04＋0.17X1＋0.36X2＋0.16X3－0.35X1X2＋0.11X1X3－0.009393X2X3－0.45X12－0.26X22－0.52 X32。 模型的可信度分析及方差分析見表 3、 表 4。

通過表3可知，該模型的復相關系數平方R2=0.9877，修正相關系數平方RAdj2=0.9657，變異系數為1.51，說明該實驗模型擬合程度良好，能夠很好地描述試驗結果，試驗誤差小，模型方程能夠很好地反映真實的試驗值，可以用此模型來分析和預測水提大紅菇多糖的工藝結果。并且由方差結果分析表（表4）可以看出，模型在p≤0.01時水平顯著，表明回歸模型極顯著，試驗設計可靠。上述回歸方程描述了各因子與響應值之間線性關系的顯著性。由F檢驗值來判定，概率p值越小，其相應變量的顯著性越高。 易知 X1、 X2、 X3、 X1X2、 X12、 X22、 X32七項對多糖提取率影響為顯著，因此各具體實驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系。

表2 Box-Behnken設計方案及試驗結果

表3 模型的可信度分析的統計檢驗結果

表4 方差分析表

2.2.3 響應曲面及等值線分析

利用Design Expert 7.1軟件對表2的數據進行二次多元回歸擬合，建立響應曲面及其等高線，結果如圖5～圖7所示。

圖5 提取溫度與時間對大紅菇多糖提取率影響的等高線和響應曲面

圖6 水料比與提取溫度對大紅菇多糖提取率影響的等高線和響應曲面

圖7 水料比與提取時間對大紅菇多糖提取率影響的等高線和響應曲面

圖5反映的是當水料比為50∶1（mL∶g）時，提取溫度和時間對大紅菇多糖提取率的影響。由圖可知，當溫度不變時，時間范圍在3 h～7 h內，隨著時間的延長多糖的提取率逐漸增加，達到極大值。當時間保持不變，溫度由80℃升高到100℃時，提取率先是逐漸增加，當溫度達到一定值后呈逐漸下降的趨勢。

圖6反映的是當提取時間為5 h時，溫度和水料比對多糖提取率的影響。從圖可以看出，水料比不變時，溫度由80℃升高至100℃過程中，提取率先是逐漸增加，達到一定值之后提取率開始下降。溫度保持不變時，水料比從30∶1（mL∶g） 升至 70∶1（mL∶g） 時，提取率逐漸增加直到達到極大值后開始緩慢下降。

圖7反映的是當溫度恒定為90℃時，水料比與提取時間對多糖提取率的影響。由圖可以看出，當水料比固定時，提取時間由3 h開始增加時多糖的提取率逐步增加，直到達到極大值。當固定某一提取時間時，水料比從50∶1逐漸增加時，其提取率也隨之增加并在某處達到極大值，而在達到最大值后提取率出現緩慢降低。

2.3 響應面的優化

通過Design Expert 7.1軟件分析，得到大紅菇多糖提取的最佳工藝條件為提取時間5.20 h，提取溫度90.39℃，水料比為56.49∶1。在此條件下大紅菇多糖提取率理論值可達7.0741%。為驗證此優化方案的可靠性，根據實際情況和實驗條件，選擇工藝條件為提取時間為5.20 h，提取溫度為91℃，水料比為57∶1，實際測得大紅菇多糖的提取率為7.0536%，與理論值的比較誤差小于0.03%。

3 結論

云南野生大紅菇多糖的最佳水提工藝條件為提取時間時間 5.20 h，提取溫度90.39℃，水料比為56.49∶1。在此條件下，實際測得的大紅菇多糖提取率可達7.0536%，與理論預測值的相對誤差較小。因此采用Box-Behneken優化得到的水提大紅菇多糖工藝條件參數準確可靠，且該結果重復性強，具有實用價值。

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