點柄粘蓋牛肝菌粗多糖體外抗氧化活性的研究*

史振霞，吳智艷

（廊坊師范學院生命科學學院，河北 廊坊 065000）

點柄粘蓋牛肝菌（Suillus granulatus）又名黃花松茸、栗殼牛肝菌，是真菌門（Enmycophyta）、擔子菌綱（Basidiomycetes）、擔子菌亞門（Basidiomycolina）、層菌綱（Hymenomycetes）、傘菌目 （Agaricales）、 牛肝菌科 （Boletaceae）、粘蓋牛肝菌屬（Suillus）的一種珍稀的食、藥兼用真菌[1]。點柄粘蓋牛肝菌營養成分全面且含量高，具有較好的醫療保健作用，其具有的抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、提高人體免疫力等功效來源于多種生理活性物質，如多糖、維生素、礦物質等，其中以點柄粘蓋牛肝菌多糖的研究為重點[2]。真菌多糖是繼核酸和蛋白質之后的另一種有待深入研究的生物大分子，具有良好的生理調節作用，可以從根本上提高人體免疫力，起到強身保健的功能，因而具有廣泛應用前景。

自由基與許多病理生理現象，如衰老、腫瘤、心血管疾病和炎癥等有關，目前國內外已將抗氧化檢測用于抗衰老等保健食品的評價，對保健品開發具有積極的作用[3，4]。本實驗使用在河北燕山山區采集的點柄粘蓋牛肝菌，通過熱水浸提、乙醇沉淀等方法，對子實體粗多糖進行提取，在此基礎上本實驗進一步對點柄粘蓋牛肝菌多糖的抗氧化活性進行驗證，以抗氧化劑Vc作為陽性對照，以測定點柄粘蓋牛肝菌粗多糖對活性氧自由基·O2-、·OH的清除能力和還原能力，并研究點柄粘蓋牛肝菌粗多糖的抗氧化活性大小與其濃度的關系，為全面開發利用點柄粘蓋牛肝菌在醫藥、食品和保健品中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

點柄粘蓋牛肝菌（Suillus granulatus），采集于河北燕山山區平泉縣遼河源國家級森林公園。

1.2 多糖提取

稱取已干燥至恒重的點柄粘蓋牛肝菌子實體6 g，在提取溫度為95℃，處理時間3.5 h，料液比1∶40條件下浸提子實體多糖，3000 r·min-1離心10 min，上清液即多糖提取液。在多糖提取液中加入3倍體積95%的乙醇沉淀多糖，冷凍干燥后得點柄粘蓋牛肝菌粗多糖。

1.3 點柄粘蓋牛肝菌粗多糖的脫蛋白

乙醇沉淀后的粗多糖類物質中含有一定的蛋白質，按上清液體積∶Sevag試劑體積4∶1的比例加入Sevag試劑，磁力攪拌器攪拌30 min，4000 r·min-1、20 min的條件下離心，取上清液，透析、乙醇沉淀、冷凍干燥后得點柄粘蓋牛肝菌粗多糖。

1.4 樣品中總糖的測定

蒽酮比色法測定樣品中總糖的含量[4-9]。

1.5 樣品中還原糖的測定

3,5-二硝基水楊酸法測定樣品中還原糖含量[9]。

1.6 樣品中多糖含量的測定

多糖的含量＝總糖含量－還原糖含量。

1.7 粗多糖體外抗氧化活性測定

1.7.1 粗多糖對·OH的清除作用

采用Fenton體系測定點柄粘蓋牛肝菌粗多糖對·OH的清除作用，即利用亞鐵離子催化過氧化氫產生·OH，由于·OH可特異地使番紅褪色，根據褪色程度用比色法來衡量·OH 的含量[9]。

反應體系中加入0.15 mol·L-1pH7.4磷酸緩沖液1.5 mL，番紅花紅（濃度 260 mg·L-1） 0.2 mL，0.56 mmol·L-1EDTANa2-Fe(Ⅱ)0.7 mL（新鮮配制），再加入不同濃度的多糖液0.8 mL，最后加入1%H2O20.8 mL（新鮮配制），混勻后于37℃水浴保溫 30 min，3000 r·min-1離心5 min，取其上清液，在波長520 nm處測吸光度值[5]。空白組以磷酸緩沖液代替樣品溶液，對照組以磷酸緩沖液代替樣品溶液和EDTANa2-Fe(Ⅱ)溶液，實驗結果以清除率（E1）表示，計算公式如下：

公司主導完善評價體系、拓展發展通道，加大基層站區長對職工評價的話語權、思想政治工作主動權；公司主導搭建關愛平臺、建設站區文化，提升基層站區長關愛職工的親和力、思想政治工作感染力。

E1=（A樣品-A空白） /（A對照-A空白） ×100%

式中：A樣品為點柄粘蓋牛肝菌粗糖液吸光度值；A空白和A對照分別為空白組和對照組吸光度值。

1.7.2 粗多糖對·O2-的清除作用

采用鄰苯三酚自氧化法[10]，在堿性條件下，鄰苯三酚能夠自氧化產生·O2-和有色中間產物（在320 nm處有最大吸收峰），·O2-又對自氧化起催化作用，依據有色中間產物生成量的多少可判斷·O2-生成量的多少。加入一定量的多糖液可對·O2-產生不同的抑制作用，進而導致吸光度值的變化[11]。

取6 mL pH8.2的Tris-HCl緩沖液，移至試管中，加入一定濃度的多糖樣品0.5 mL，37℃溫浴10 min，最后加入37℃預熱過的7 mmol·L-1鄰苯三酚鹽酸溶液 1 mL，混勻，精確反應4 min，立即用0.5 mL濃鹽酸終止反應[12]，測320 nm處吸光度值[13]。對照組以Tris-HCl緩沖液代替糖液。空白組以Tris-HCl緩沖液代替糖液和鄰苯三酚鹽酸溶液。實驗結果以清除率（E2）表示，計算公式如下:

E2=(A對照-A樣品)/(A對照-A空白) ×100%

式中：A樣品為點柄粘蓋牛肝菌粗多糖液吸光度值；A空白和A對照分別為空白組和對照組吸光度值。

試驗采用Oyaizu法，通過觀察在多糖存在時，Fe3+-Fe2+的轉移來檢測其還原能力。取1.0 mL不同濃度的點柄粘蓋牛肝菌多糖液，移至試管中，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液（pH6.6）以及2.5 mL質量分數為1.0%的鐵氰化鉀溶液，混合均勻后將該體系置于50℃恒溫水浴中恒溫20 min，然后加入2.5 mL質量分數為10%的三氯乙酸溶液，混合均勻，置于離心機內3000 r·min-1離心10 min。移取2.5 mL上清液于另一試管中，加入2.5 mL蒸餾水及0.5 mL質量分數為0.1%的三氯化鐵溶液，混合均勻，在波長700 nm處測定體系的吸光度[14-16]，吸光度值越大說明多糖的還原能力越強[13]。

2 結果分析

2.1 總糖、還原糖的標準曲線

蒽酮比色法測定總糖含量的標準曲線的回歸方程為y=0.03876+7.90571x，r=0.99815；3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖的標準曲線的回歸方程為y=0.03671+2.16257x，R=0.99647。

2.2 粗多糖對·OH的清除作用

采用Fenton體系測定粗多糖對·OH的清除作用，結果見圖1。

由圖1可知，在一定的濃度范圍內，多糖對羥基自由基的清除能力隨著多糖濃度的增加而增強，多糖濃度為0.2 mg·mL-1時能達到最大清除率（98.95%），而后隨著多糖濃度的增加而變化不大。而Vc在濃度為0.02 mg·mL-1時清除率為80%，可見多糖對·OH的清除能力很強。

2.3 粗多糖對·O2-的清除作用

粗多糖對·O2-的清除效果見圖2。

由圖2可知，在一定的濃度范圍內，多糖濃度越高，對超氧陰離子自由基的清除率也越高，而后隨著多糖濃度的增加變化不太明顯。多糖濃度為10 mg·mL-1時能達到最大清除率（21.68%），而Vc在濃度為10 mg·mL-1時清除率為97.69%，可見與Vc相比點柄粘蓋牛肝菌粗多糖對·O2-的清除作用不太明顯。

2.4 粗多糖的還原能力

點柄粘蓋牛肝菌粗多糖的還原能力見圖3。

由圖3可知，點柄粘蓋牛肝菌粗多糖有一定的還原能力，且還原能力隨著多糖濃度的增加而增強，多糖濃度（x，mg·mL-1）與還原能力（y，%）之間的回歸方程為：y=0.03004+0.00996x，R=0.98841。

3 結論

本試驗通過用熱水浸提點柄粘蓋牛肝菌子實體，乙醇沉淀多糖Sevag法去除多糖中的蛋白，并采用Fenton體系、鄰苯三酚自氧化法、Oyaizu法測定了點柄粘蓋牛肝菌多糖對·OH、·O2-的清除能力和還原能力，為新藥或保健食品開發研究奠定了一定的理論基礎。

研究表明點柄粘蓋牛肝菌多糖具有較好的抗氧化活性，具有很強的還原能力，對羥基自由基具有較好的清除作用，當多糖濃度為0.2 mg·mL-1時達到最大清除率98.95%，而對超氧陰離子的清除作用不太明顯，當多糖濃度為10 mg·mL-1時其最大清除率為21.68%，而在相同條件下Vc濃度為10 mg·mL-1時，其清除率為97.69%，點柄粘蓋牛肝菌多糖的還原能力良好且還原能力隨著濃度的增加而增強， 多糖濃度（x,mg·mL-1）與還原能力（y，%）之間的回歸方程為y=0.03004+0.00996x，R=0.98841。試驗結果表明點柄粘蓋牛肝菌粗多糖具有一定的抗氧化活性，尤其對其清除·OH的活性值得進一步研究和開發。

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