紅菇子實體多糖的提取及其抗氧化活性研究

李碧嬋 ，李 淼，王賀祥*

（1.武夷學院茶學與生物系，福建 武夷山 354300；2.中國農業大學生物學院農業生物技術國家重點實驗室，北京 100193）

多糖又稱多聚糖（Polysaccharide），是由醛糖或酮糖通過脫水形成糖苷鍵，并以糖苷鍵線性或分枝連接而成的鏈狀聚合物。一般聚合度大于10，分子量為數萬至數百萬[1]。多糖是構成生命活動的四大基本物質之一，廣泛存在于生物體中，與生命的多種生理功能密切相關，具有重要的保健和臨床應用價值。目前已有不少關于食用菌如豬苓、香菇、靈芝、云芝等多糖的研究。

紅菇（Russula）是一類大型菌根真菌，屬擔子菌門、擔子菌綱、紅菇目、紅菇科、紅菇屬[2]。紅菇中含有豐富的碳水化合物、蛋白質、氨基酸、維生素以及人體必需的微量元素，具有極高的營養保健價值。近年來的研究發現，紅菇有抗癌、降血糖、降血脂、提高機體免疫力、抑菌、清除自由基、修復甲醛所致的氧化損傷等功效[3-10]。閩北是正紅菇（Russula vinosa Lindlad）的著名產區[11]。本文對閩北正紅菇中的主要活性物質紅菇多糖的提取方法和體外抗氧化活性進行了研究，為進一步開發利用閩北紅菇提供了理論依據。

1 實驗材料

1.1 材料

正紅菇子實體，購自武夷山。

1.2 試劑

DEAE-cellulose購自美國Sigma公司；蒽酮、乙酸乙酯、蔗糖、鐵氰化鉀、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過氧化氫、亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、乙醇等試劑均為分析純（AR）；水為重蒸水。

2 實驗方法

2.1 紅菇多糖的提取

紅菇子實體流水沖洗去泥沙，60℃烘干至恒重，粉碎；然后稱取一定量菇粉于錐形瓶中，加水浸提，重復2次，減壓過濾后用旋轉蒸發儀濃縮；再加入3倍體積乙醇，封口，靜置過夜，離心分離，沉淀物經真空干燥即為粗多糖。

2.2 紅菇多糖的純化

將粗多糖溶于水，Sevage法除去蛋白質，再乙醇沉淀，沉淀物抽濾干燥，依次用丙酮、乙醚洗滌，真空干燥得到紅菇多糖半純品。將該多糖溶于水，抽濾，濾液上DEAE-纖維素層析柱（2.5 cm×20 cm），用 0～1.0 mol·L-1NaCl緩沖液梯度洗脫，測定各管洗脫液在波長280 nm的吸光度，合并各分段洗脫液。

2.3 多糖含量及得率的測定

多糖含量測定：采用蒽酮-硫酸法測定，多糖得率（%）為粗多糖重量與子實體干粉重量的百分比值。

2.4 紅菇多糖還原力的測定

用Oyaizu等提出的還原三價鐵離子法測定正紅菇多糖的還原能力[12]。具體步驟如下：取pH 6.6的磷酸緩沖液和質量分數為0.1%的鐵氰化鉀溶液各2.0 mL，分別加入不同質量濃度的多糖溶液2.0 mL，混勻后50℃水浴20 min，速冷，然后加入質量分數為10%的三氯乙酸溶液2 mL，混勻，3000 r·min-1離心10 min，取上清液2.0 mL，再加入質量分數為0.3%的氯化鐵0.4 mL，混勻，然后加入2.0 mL蒸餾水，混勻，以蒸餾水調零，在波長700 nm處測定吸光度。以抗壞血酸作為陽性對照，平行測定3次。

2.5 紅菇多糖清除·OH能力的測定

用Fenton反應法產生羥基自由基（·OH），H2O2/Fe2+體系可以通過Fenton反應產生羥基自由基（·OH），其反應式如下：

H2O2+Fe2+→·OH+OH－+Fe3+

溶液中的鄰二氮菲-Fe2+水溶液（紅色）氧化為鄰二氮菲-Fe3+（褪色），以此測定·OH數量的變化，實現抗氧化劑清除自由基能力的測定[13]。

精密量取pH7.4 PBS緩沖液2.0 mL和8.0 mL重蒸水，混勻做空白參比管。

依次精密量取鄰二氮菲溶液（5 mmol·L-1）1.0 mL，PBS緩沖液2.0 mL， 硫酸亞鐵溶液（7.5 mmol·L-1）1.5 mL和重蒸水5.5 mL，混勻做未損傷管；依次精密量取鄰二氮菲溶液（5 mmol·L-1） 1.0 mL，PBS緩沖液 2.0 mL，硫酸亞鐵溶液（7.5 mmol·L-1） 1.5 mL，H2O2（0.1%） 1.0 mL 和重蒸水4.5 mL，混勻做損傷管。

依次精密量取鄰二氮菲溶液（5 mmol·L-1）1.0 mL，PBS緩沖液 2.0 mL， 硫酸亞鐵溶液（7.5 mmol·L-1）1.5 mL，H2O2（0.1%）1.0 mL，分別加入不同濃度的多糖溶液和重蒸水共4.5 mL，混勻做樣品管，以抗壞血酸作為標準抗氧化劑，將上述試管同時置于37℃恒溫水浴中，60 min，以空白參比管調零，在536 nm處測定吸光度，計算羥自由基清除率（d）。平行測定3次。式中：A1為加樣管在536 nm處吸光度；A2為損傷管在536 nm處吸光度；A3為未損傷管在536 nm處吸光度。

2.6 紅菇多糖在體外模擬胃液條件下清除NO2－的反應

準確量取不同濃度多糖溶液5.0 mL于25 mL的比色管中，加入pH為3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液5.0 mL，5 mg·L-1NaNO2溶液2.0 mL，于37℃恒溫水浴鍋中恒溫反應1 h，加入0.4%對氨基苯磺酸2.0 mL，搖勻靜置5 min，再加入0.2%鹽酸萘乙二胺1.0 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻靜置15 min。在540 nm處測其吸光度。以抗壞血酸為對照。清除率計算公式如下：

式中：E為清除率；A0為未加多糖時測定的NaNO2的吸光度；A為加多糖時測定的NaNO2的吸光度。

3 結果與分析

3.1 提取紅菇多糖的正交實驗

選取水料比、浸提時間、浸提溫度3個對多糖提取影響較大的因素，按L9（34）設計三因素三水平試驗 （表1）。試驗結果如表2所示。

表1 試驗因子和水平表L9(34)

表2 紅菇多糖提取正交試驗設計與結果

由表2中極差分析結果可知，各因素對紅菇多糖得率影響的主次順序為：A>C>B，即水料比對多糖得率的影響最大，浸提時間比水料比的影響稍小，浸提溫度的影響最小。各極差結果有A因素列為K3>K2>Kl，B因素列為K1>K3>K2，C因素列為K3>K2>Kl。從實驗結果分析得出較優方案為：A3B1C3，即水料比為30，浸提溫度60℃，浸提時間3 h。在此提取條件下，多糖得率為4.326%。從水料比因素中最好的水平是A3，溫度最好的水平是B1，浸提時間最好的水平是C3，這三個水平組合起來即A3B1C3，這正好是實驗號7的實驗條件，所以可以確定A3B1C3是最優方案。在這個條件下做驗證實驗得到的實驗結果是多糖得率為4.335%，因此取平均值紅菇多糖得率為4.33%。

3.2 粗多糖的糖含量分析

以蒽酮-硫酸法測定，得到糖濃度含量x（g）與吸光度y之間的線性方程 y=0.0065x+0.0014，相關系數R2=0.9994，由此計算出粗多糖的糖含量為（45.83±0.54）%。

3.3 紅菇多糖的純化

粗多糖經Sevage法去蛋白、DEAE-纖維素陰離子交換柱層析，分段洗脫后得到4個吸收峰D1、D2、D3和D4，經蒽酮-硫酸法檢測均為多糖。其中D1組分多糖含量最高，其次為D4、D3，D2組分多糖含量最少。洗脫曲線如圖1所示。

3.4 紅菇多糖還原力的測定

紅菇多糖的還原力測定結果見表3和表4。

表3 紅菇粗多糖的還原力測定

從表3測定結果可以看出，紅菇多糖具有一定的還原力，且隨著劑量的增加，還原力逐漸增強。但與Vc相比，其還原力較弱，紅菇多糖劑量為125 μg·mL-1時的還原能力才與 3.75 μg·mL-1的 Vc 相當（p＞0.05）。

由表4可知，不同劑量的紅菇多糖組分具有一定的還原力，且隨著紅菇多糖組分劑量的增加，其還原力逐漸增強。在相同劑量下，不同紅菇多糖組分的還原力大小依次為D4、D3、D2、D1。其中D1組分還原力較紅菇粗多糖弱。D4、D3、D2組分的還原力優于紅菇粗多糖，在劑量為12.5 μg·mL-1時，超過粗多糖 75 μg·mL-1時的還原力。 但與 Vc相比，其還原力較弱。D4、D3、D2、D1組分的還原力分別為同劑量Vc的27.62%、17.62%、12.38%、1.35%。

3.5 紅菇多糖清除羥基自由基（·OH）的能力測定

紅菇多糖清除·OH試驗結果見表5、表6。

表4 紅菇多糖不同組分還原力測定

表5 紅菇粗多糖對·OH的清除效果

表6 紅菇多糖不同組分對·OH的清除效果

從表5可以看出，紅菇多糖和Vc對·OH均有清除作用，在 50 μg·mL-1～800 μg·mL-1之間隨著劑量增加，清除率明顯上升，特別是劑量從 400 μg·mL-1增到 600 μg·mL-1時，清除率從22.95%躍升到65.32%；此后隨著劑量的增加，清除率緩慢上升，當劑量增加到800 μg·mL-1時，清除率達到最大，為77.66%。而Vc溶液在該劑量范圍內清除率在4.97%～72.06%之間，也隨著劑量增加而增加。

當紅菇多糖劑量增加到 600 μg·mL-1和 800 μg·mL-1時，清除率優于 Vc（p＜0.01），劑量增加到 1000 μg·mL-1時清除率與同劑量Vc相當，無顯著差異（p＞0.05），說明紅菇多糖對·OH具有良好的清除作用。

不同紅菇多糖組分對·OH的清除效果如表6所示，不同劑量的紅菇多糖組分對芬頓體系產生的·OH自由基均有一定的清除作用，且隨著紅菇多糖組分劑量的增加，其清除效果逐漸增強。 在劑量為 25 μg·mL-1時，D1、 D2、 D3、D4對·OH的清除率分別是 4.63%、39.80%、28.51%和53.13%，以D4對·OH的清除效果最佳。在低劑量時，純化后的多糖對·OH的清除效果優于粗多糖及Vc。其中D1組分在劑量為100 μg·mL-1時對·OH的清除率分別是同劑量粗多糖的3.78倍，Vc的1.71倍；而D2、D3、D4組分在使用劑量為25 μg·mL-1時，對·OH的清除率均超過粗多糖 400 μg·mL-1時的清除率； 在該使用劑量下，D2、 D3組分對·OH的清除率超過 Vc為 200 μg·mL-1時的清除率（20.44%），D4組分對·OH的清除率超過 50%，超過 Vc 400 μg·mL-1時的清除率（48.45%）。 由此可知 D4具有很強的清除·OH的活性。

3.6 紅菇多糖在體外模擬胃液的NO2－清除反應

亞硝酸鹽（NO2－）是亞硝胺的前體物，亞硝胺是人和動物的強致癌物，它能引起人體和動物的肝臟等多種器官的惡性腫瘤。通過消除體內的NO2－，可以明顯減少患癌的比率[14]。實驗結果如表7所示。

表7 紅菇粗多糖在體外模擬胃液條件下對NO2-的清除效果

由表7測定結果可見，紅菇粗多糖和Vc均能有效清除NO2－，且隨著劑量的增加，清除率呈現出明顯的梯度變化。 紅菇多糖劑量從 125 μg·mL-1增至 375 μg·mL-1時，清除率顯著增加，當用量達到375 μg·mL-1時,清除率達到最大45.3%，再增加多糖的劑量時，清除率反而下降。而Vc劑量為125 μg·mL-1時，清除率即超過 50%，能顯著清除NO2－，且隨著Vc劑量增加，清除率增大；Vc的清除率顯著高于同劑量的紅菇粗多糖（p＜0.01）。

不同紅菇多糖組分在體外模擬胃液條件下對NO2－的清除效果不同，D4組分在體外模擬胃液條件下對NO2－有一定的清除作用，且隨著多糖劑量的增加，清除率呈現出明顯的梯度變化；在劑量為100 μg·mL-1時，D4組分對NO2－的清除率超過粗多糖在125 μg·mL-1時的清除率。但較Vc弱。其余各組分對NO2－均無清除作用。

4 討論

許多研究表明食用菌類的多糖對ROS具有清除作用，能減少脂質過氧化產物的生成量，增加超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px)活性，具有良好的抗氧化性能，且毒副作用小，是具有清除自由基和代謝調節作用的天然物質。從正紅菇子實體中提取得到紅菇粗多糖，經脫蛋白、DEAE-纖維素陰離子交換柱層析分離得到 D1、 D2、 D3和 D4四個組分。

實驗結果表明，紅菇粗多糖及其各組分具有一定的還原能力，對芬頓體系產生的·OH有較好的清除作用，在體外模擬胃液條件下對NO2－有一定的清除效果，說明紅菇多糖具有一定的抗氧化作用。與Vc相比，紅菇多糖在還原能力和清除NO2－的能力要弱很多，而在清除·OH方面卻顯示了極強的能力。尤其是D4組分，在極低的濃度下（25 g·mL-1）對·OH的清除率超過50%，超過Vc濃度400 μg·mL-1時的清除率（48.45%）。

上述實驗表明，紅菇多糖的開發利用為真菌多糖提供了新的材料和數據，為篩選抗氧化藥物提供了理論依據，并可為紅菇的進一步研究和開發利用提供依據。

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