內皮型氧化亞氮合酶基因G894T、胰島素受體基因第17外顯子多態性與老年癡呆的關系研究

周偉宏,吳永華

(江蘇省蘇州市立醫院老年科,江蘇蘇州,215002)

近年來,隨著世界人口老齡化速度的加快,老年癡呆患者逐年增加,給家庭及社會造成了沉重的負擔。老年癡呆研究逐漸成為熱點[1]。阿爾茨海默病(AD)與血管性癡呆(VaD)是老年人癡呆的兩大主要病因。同時近年來國內外研究發現[2-3]內皮型氧化亞氮合酶基因G894T多態性、胰島素受體基因第17外顯子(1058位點)多態性與動脈硬化、高血壓、冠心病、腦卒中等有關。但很少有將AD和VaD放在一起進行相關性的研究報道[4]。本研究選取阿爾茨海默病與血管性癡呆患者各50例,探討內皮型氧化亞氮合酶基因第7外顯子G894T多態性、胰島素受體基因第17外顯子多態性與老年癡呆的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年3月～2012年4月本院門診及住院的AD患者50例作為AD組。經簡易精神狀態檢查表(MMSE評分)和美國精神醫學協會《精神疾病診斷與統計手冊》第4版(DSM-Ⅳ)診斷為癡呆,缺血指數量表(Hachinski)評分<4分,均符合美國神經病學、語言障礙和卒中-老年性癡呆和相關疾病協會(NINCDS-ADRAD)AD診斷標準。另選VaD患者50例為VAD組,經MMSE評分和DSM-Ⅳ診斷為癡呆,Hachinski評分>7分,符合美國國立神經病學與中風研究所-神經科學國際研究協會(NINDS-AIREN)VaD診斷標準。對照組為同期收集的健康老年人50例。無糖尿病、高血壓、心臟疾病及神經系統疾病,MMSE評分正常。受試者在年齡、性別、空腹血糖、甘油三酯、膽固醇、收縮壓、舒張壓比較均匹配(P>0.05)。見表1。

表1 3組患者一般臨床資料比較( x±s)

1.2 方法

1.2.1 血液基因組DNA的提取:于肘靜脈處抽取受試者清晨空腹靜脈血5 mL,-20℃保存,采用全血基因組DNA提取試劑盒進行基因分析。

1.2.2 eNOS G894T基因型測定:應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性方法(PCRRFLP),擴增eNOS G894T基因片段的引物序列分別為:上游 5′-ACAGAATTCGCCCCGGCCTG GTACAC-3′、下游 5′-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3′。反應條件:94 ℃變性30 s,63℃退火30 s,72℃延伸1 min,40個循環,取PCR擴增產物10 μ L和酶切體系10 μ L,10×緩沖液10 μ L,去離子水3 μ L,入重蒸水使總體積為50 μ L,37℃酶切16 h,用限制性內切酶PmⅡ進行消化,取酶切產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,觀察結果。

1.2.3 INSR基因第17外顯子(1058位點)基因型測定:應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性方法(PCR-RFLP),第17外顯子PCR擴增引物,上游為:5′-CCAAGGATGCTGTGTAGA TAAG-3′,下游為:5′-TCAGGAAAGCCAGC C-3′。PCR完畢后,用限制性內切酶PmlI進行消化,取酶切產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,觀察結果。

2 結 果

2.1 GG、GT和TT基因型分布頻率

AD組、VaD組與對照組的GG、GT和TT基因型分布頻率分別比較,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 受試者的G894T基因型分布(%)

2.2 INSR T等位基因頻率

AD組患者的INSR T等位基因頻率高于對照組,但差異不明顯(P>0.05)。VAD組患者的INSR T等位基因頻率顯著高于對照組(P<0.05),GG、GT和 TT基因型分布頻率和 INSR T等位基因頻率在AD組和VaD組無顯著差異。各基因型分布符合 Harding Weinberg定律。見表3。

表3 受試者的INSR基因第17外顯子各等位基因分布[n(%)]

3 討 論

近年來,隨著對AD發病機制研究的不斷深入,逐漸發現血管源性因素在AD的發生、發展中起著重要作用。許多證據表明[5]腦血管病和AD存在多種相同的血管因素。本實驗從基因層面揭示AD和VaD的共性,為進一步證明AD和VaD可能并非兩個獨立疾患提供新的證據,也為將來可能的基因治療提供新的途徑。到目前為止,已經發現了十多種eNOS的基因多態性位點[6],其中內皮型氧化亞氮合酶基因G894T突變與原發性高血壓、冠心病存在相關關系[7]。本研究通過應用PCR-RFLP,發現AD組患者和VaD組的GG、GT和 TT基因型分布頻率與對照組患者相應的基因型分布頻率比較,差異都有統計學意義(P<0.05),表明內皮型氧化亞氮合酶基因G894T的多態性與AD和VaD的發生、發展可能存在相關性。該研究結果可能對阿爾茨海默病以及血管性癡呆的基礎研究和臨床防治有一定指導意義。Watanabe等[8]的研究提示動脈粥樣硬化可能為AD和VaD的獨立危險因素,可能由于不同地區人種的差異導致。

近年來胰島素受體基因第17外顯子多態性被證實與動脈粥樣硬化、高血壓病、糖尿病的獨立危險因素[9]。胰島素/胰島素受體信號級聯系統正常運行也是維持大腦血液運行和能量代謝正常進行的關鍵因素。本研究發現AD組患者和VAD組患者的INSR T等位基因頻率高于對照組,可能是由于胰島素受體mRNA定位于神經元的胞體上,在海馬和額葉前皮層齒狀回和海馬CA1和CA3區有大量的胰島素受體分布。海馬CAI和齒狀回的胰島素受體mRNA上調和胰島素受體增多可以改善學習過程,胰島素及胰島素信號系統可能直接參與認知功能[10-12]。可以推測胰島素受體缺陷導致大腦神經細胞胰島素信號傳導障礙可以引起認知功能障礙,這與孫紅[9]相關性結果一致。本研究GG、GT和 TT基因型分布頻率和INSR T等位基因頻率在AD組和VaD組無顯著差異。可能提示AD和VaD在基因層面存在著共性,也可能由于樣本量較少未統計出差異,有待于進一步研究證實。

綜上所述,由于目前對于AD和VaD的早期診斷、早期干預成為熱點,但至今無針對AD和VaD有效的治療方法。要找到有效的方法,就需要大量更深入的研究,更詳盡揭示AD和VaD的本質及發病機制,本研究證實AD和VaD存在相同的基因危險因素[13-14],為更深入的揭示AD和VaD的發病機制及2者間共性提供新的證據。

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