去甲基斑蝥素N-乳糖酰殼聚糖納米粒的吸收機(jī)制及小鼠抑瘤作用研究

貝永燕，管敏，周奕，許靜玉，薛成文，胡展紅，張學(xué)農(nóng)，2#（.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇蘇州2523；2.蘇州利元醫(yī)藥科技有限公司，江蘇蘇州 25002）

去甲基斑蝥素（Norcantharidin，NCTD）是由我國(guó)首先開(kāi)發(fā)的治療肝癌及肝炎的新藥，主要用于原發(fā)性肝癌的治療，但其口服劑量過(guò)大時(shí)會(huì)出現(xiàn)消化道刺激癥狀和泌尿系統(tǒng)毒性，使其在臨床的使用受到很大限制。納米粒是當(dāng)前藥劑學(xué)研究中的一種新型亞微粒給藥系統(tǒng)，具有調(diào)節(jié)釋藥速度、改善藥物口服吸收、提高生物利用度、改變藥物體內(nèi)分布、降低藥物毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，已成為國(guó)內(nèi)外藥劑學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[1]。本文制備了去甲基斑蝥素N-乳糖酰殼聚糖納米粒（NCTD-GCNPs），利用納米粒可被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬達(dá)到被動(dòng)靶向的特點(diǎn)；同時(shí)以N-乳糖酰殼聚糖作為載體，而肝細(xì)胞表面的去唾液酸糖蛋白受體可與半乳糖殘基特異性地識(shí)別，從而達(dá)到主動(dòng)/被動(dòng)雙重主動(dòng)靶向作用。再利用結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞和肝癌模型小鼠分別研究藥物及制劑的吸收機(jī)制和體內(nèi)抑瘤作用，為NCTD開(kāi)發(fā)新型給藥系統(tǒng)提供重要依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

XDS-1A倒置生物顯微鏡（深圳市賽亞泰科儀器設(shè)備有限公司）；Model ELx 808全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；LC-10A高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司）；M illicellTM底膜培養(yǎng)皿（美國(guó)M illipore公司）。

1.2 試藥

N-乳糖酰殼聚糖（蘇州大學(xué)藥劑實(shí)驗(yàn)室合成）；NCTD對(duì)照品（蘇州蘇瑞醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)：20060508，純度：99.21%）；氧化苯胂（北京華威銳科化工有限公司）；疊氮化鈉（浙江省東陽(yáng)市天宇化工有限公司）；環(huán)孢素A（福建科瑞藥業(yè)有限公司，批號(hào)：060801，含量：99.3%）；去氧膽酸鈉（上海中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司，批號(hào)：F20070521）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物與細(xì)胞

C57BL/6小鼠，♀♂各半，體重（20±2）g，由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK（蘇）2007-0035；小鼠肝癌細(xì)胞H22和結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞（復(fù)旦大學(xué)生物細(xì)胞庫(kù)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 NCTD-GC-NPs的制備[2，3]

稱(chēng)取N-乳糖酰殼聚糖0.1 g，溶解于0.2%的乙酸水溶液中，制得2mg·m L－1的殼聚糖高分子溶液，加入適量NCTD后，置于 35 ℃水浴中，500 r·m in－1攪拌溶解，逐滴加入 1.2mg·m L－1的三聚磷酸鈉溶液，繼續(xù)攪拌30min，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，得乳白色納米粒溶液，并進(jìn)行相關(guān)質(zhì)量評(píng)價(jià)，結(jié)果納米粒粒徑分布為單峰分布，平均粒徑為（118.70±8.84）nm，包封率為（57.92±0.40）%，載藥量為（10.38±0.06）%，回收率為（98.31±0.35）%。

2.2 細(xì)胞樣品NCTD含量分析方法[4]

2.2.1 色譜條件。色譜柱：Hypersil ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-pH3.1磷酸水溶液（10∶90，V/V）；流速：0.8m L·m in－1；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 樣品處理及方法學(xué)考察。取細(xì)胞樣品100μL，置于EP管中，超聲粉碎，13 000 r·min－1離心10min，取上清液20 μL進(jìn)樣。以峰面積（A）為橫坐標(biāo)，濃度（c）為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A＝645.19c+528.38（r＝0.998 8，n＝5），NCTD檢測(cè)濃度在2～80μg·m L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率為（100.63±1.25）%，RSD為1.03%。

2.3 吸收機(jī)制研究[5]

2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)。應(yīng)用DMEM培養(yǎng)液（高糖）：包括10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%丙酮酸鈉、1%谷氨酰胺和1%青-鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)在75 cm2卡氏培養(yǎng)瓶，置于37℃培養(yǎng)箱中，通入5%CO2（相對(duì)濕度90%）。

2.3.2 Caco-2細(xì)胞形態(tài)與酶表達(dá)。用倒置顯微鏡觀察Caco-2細(xì)胞接種到35mm2培養(yǎng)皿中培養(yǎng)15 d時(shí)細(xì)胞單分子層的形態(tài)。細(xì)胞經(jīng)堿性磷酸酶染色觀察細(xì)胞的標(biāo)志酶活性，結(jié)果顯示，Caco-2細(xì)胞經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)分化后，具有較高的堿性磷酸酶活性，說(shuō)明細(xì)胞在M illicell膜上生長(zhǎng)完全。Caco-2細(xì)胞及其經(jīng)堿性磷酸酶染色的顯微鏡圖見(jiàn)圖1。

2.3.3 跨膜電阻值的測(cè)定。Caco-2細(xì)胞以50 000個(gè)/cm2密度種植于M illicell膜上，分別于接種后第0、3、7、13、21天測(cè)定M illicell膜上細(xì)胞膜的跨膜電阻值，扣除本底值，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1結(jié)果表明，13 d以后跨膜電阻值趨向于平穩(wěn)，說(shuō)明細(xì)胞已形成完整、致密的單層膜，可用于轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)的研究。

圖1 顯微鏡圖（×10）A.Caco-2細(xì)胞；B.經(jīng)堿性磷酸酶染色后的Caco-2細(xì)胞Fig 1 m icroscopic grap（h×10）A.Caco-2 cell；B.Caco-2 cellafter staining of alkaline phosphatase

表1 不同時(shí)間Caco-2細(xì)胞膜的跨膜電阻值比較（n＝3）Tab 1 Comparison of transmembrane resistance value of Caco-2 cellm embrane at different tim e（n＝3）

2.3.4 酚紅轉(zhuǎn)運(yùn)。于Caco-2細(xì)胞種植后的第3、7、13、21天分別在膜上層吸去原培養(yǎng)液，在原培養(yǎng)液的上層加入含有一定濃度（100μg·m L－1）酚紅的培養(yǎng)液0.5m L，下層加入1.5m L空白pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）。2 h后取下層液體0.3m L加入10倍量的氫氧化鈉顯色，紫外分光光度計(jì)（波長(zhǎng)為559 nm）測(cè)定其酚紅吸光度（A），按公式計(jì)算酚紅透過(guò)率（P）。P/%＝（ABL×VBL）/（AAP×VAP×t）×100%（式中，ABL為下層透過(guò)液體測(cè)得的吸光度；VBL為下層透過(guò)液體的體積；AAP為上層酚紅培養(yǎng)液的吸光度；VAP為上層酚紅培養(yǎng)液的體積；t為轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間）。不同時(shí)間Caco-2細(xì)胞膜的酚紅透過(guò)率比較見(jiàn)表2。

表2 不同時(shí)間Caco-2細(xì)胞膜的酚紅透過(guò)率比較（n＝3）Fig 2 Com parison of transport amount of phenol red in Caco-2 cellmembraneat different time（n＝3）

表2結(jié)果表明，13 d以后P＜0.5%，說(shuō)明細(xì)胞已形成完整、致密的單層膜，可用于轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)的研究。

2.3.5 不同轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑對(duì)NCTD-GC-NPs轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。用pH 7.4 PBS溶液稀釋制備以NCTD計(jì)濃度為80μg·m L－1的NCTD-GC-NPs水溶液，經(jīng)過(guò)濾除菌。取細(xì)胞生長(zhǎng)完全的M illicell膜，加入NCTD-GC-NPs（80 μg·m L－1，參照組）及其分別與P糖蛋白外排抑制劑環(huán)孢素A（50μmol·L－1，環(huán)孢素A組）、細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)劑去氧膽酸鈉（100mmol·L－1，去氧膽酸鈉組）、能量抑制劑疊氮化鈉（25mmol·L－1，疊氮化鈉組）、內(nèi)吞抑制劑氧化苯胂（25mmol·L－1，氧化苯胂組）混合后的等滲溶液，培養(yǎng)20min后取細(xì)胞超聲粉碎，轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液20 μL注入進(jìn)樣測(cè)定藥物濃度，按下式計(jì)算表觀透過(guò)系數(shù)（Papp）：Papp＝（dQ/dt）/（A×c0），其中dQ/dt表示單位時(shí)間的累積透過(guò)量，A表示膜表面積（≈1.1 cm2），c0表示藥物的初始濃度，結(jié)果詳見(jiàn)表3。

表3 各組Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)的表觀透過(guò)系數(shù)比較（x ±s，n＝3）Tab 3 P app of differentgroups in Caco-2 ce（llx ±s，n＝3）

表3結(jié)果表明，與參照組比較，環(huán)孢素A組、疊氮化鈉組和去氧膽酸鈉組的表觀透過(guò)系數(shù)均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），說(shuō)明促進(jìn)藥物主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的作用比較明顯。氧化苯胂組與參照組比較無(wú)明顯變化，說(shuō)明其對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)明顯影響。

2.4 抑瘤作用研究

將接種肝癌細(xì)胞H22后的小鼠隨機(jī)分為空白組、對(duì)照組（NCTD原料藥2mg·kg－1）和NCTD-GC-NPs低、中、高劑量組（0.5、2、4mg·kg－1），每組10只，每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥8 d。每日記錄各組小鼠體重變化，測(cè)量腋下腫瘤的長(zhǎng)和寬，并計(jì)算腫瘤的體積＝（長(zhǎng)×寬×高）/2。8 d后處死各組小鼠，完整剝離腫瘤，稱(chēng)重，以抑瘤率（抑瘤率/%＝（1－實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/空白組平均瘤重）×100%）的大小判斷對(duì)腫瘤的抑制作用。稱(chēng)重后用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，制片，蘇木素-伊紅（HE）染色，以配有電子成像技術(shù)的生物顯微鏡觀察各組小鼠腫瘤的病理學(xué)變化，并對(duì)典型區(qū)域進(jìn)行拍照。各組小鼠的體重和抑瘤率比較見(jiàn)表4，腫瘤的病理學(xué)觀察見(jiàn)圖2（A、B、C、D為擴(kuò)大4倍，E為擴(kuò)大40倍）。

表4 各組小鼠的體重和抑瘤率比較（n＝10）Tab 4 Bodyweightofm iceand anti-tumor rate（n＝10）

表4結(jié)果表明，與空白組比較，其余各組小鼠瘤重均明顯減輕（P＜0.05或P＜0.01）；與對(duì)照組比較，NCTD-GC-NPs中、高劑量組抑瘤率明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。可見(jiàn)，經(jīng)半乳糖修飾及納米粒化后可提高NCTD對(duì)小鼠的抑瘤作用。

圖2 各組小鼠腫瘤的病理學(xué)觀察A.空白組；B.對(duì)照組；C.NCTD-GC-NPs低劑量組；D.NCTD-GC-NPs中劑量組；E.NCTD-GC-NPs高劑量組Fig 2 Pathologicalobservation of tumor in each group A.blank group；B.control group；C.NCTD-GC-NPs low-dose group；D.NCTD-GC-NPs medium-dose group；E.NCTD-GC-NPs high-dose group

由圖2可知，空白組和對(duì)照組多見(jiàn)大片腫瘤組織和少量腫瘤壞死組織，NCTD-GC-NPs低、中劑量組多見(jiàn)大片腫瘤壞死組織，直觀反映出納米粒增強(qiáng)了NCTD對(duì)腫瘤的殺傷作用。NCTD-GC-NPs高劑量組腫瘤壞死組織的放大圖，可見(jiàn)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，左上角為腫瘤細(xì)胞，圖中央大片為炎癥細(xì)胞，間接反映了機(jī)體的免疫功能狀況及對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。

3 討論

本文以N-乳糖酰殼聚糖為載體，通過(guò)離子交聯(lián)法，制備得NCTD-GC-NPs。采用Caco-2細(xì)胞模型研究了NCTD及其肝靶向納米粒制劑的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，研究了藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)受外排、內(nèi)吞和旁路轉(zhuǎn)運(yùn)作用的影響因素。研究了NCTD和NCTD-GCNPs在肝癌模型小鼠體內(nèi)的抑瘤作用，證實(shí)藥物經(jīng)半乳糖修飾及納米粒化后可提高其抑瘤作用。另外由于Caco-2細(xì)胞與小腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)類(lèi)似，筆者認(rèn)為NCTD-GC-NPs主要是穿過(guò)小腸上皮細(xì)胞。綜上所述，NCTD-GC-NPs主要通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)小腸上皮細(xì)胞，能明顯抑制肝癌腫瘤細(xì)胞H22的生長(zhǎng)。

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