幽門螺桿菌rdxA和cagA基因突變與甲硝唑耐藥的相關(guān)性研究Δ

張 姝，莫 非，張 然，孫朝琴，王 瑩，李 寅，羅昭遜，夏曙華（貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)教研室，貴陽(yáng)550004）

幽門螺桿菌（Hp）是慢性胃炎、消化性潰瘍的重要致病因素，與胃癌和胃黏膜相關(guān)性淋巴組織淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)[1]。目前使用抗菌藥物根除Hp感染是治療Hp相關(guān)性胃炎、消化性潰瘍的主要方法。抗菌藥物的廣泛使用使Hp對(duì)抗菌藥物的耐藥性不斷升高，其中對(duì)甲硝唑（MTZ）的耐藥性尤為突出[2]。國(guó)外有學(xué)者Goodw in等[3]報(bào)道，Hp的編碼基因（rdxA）變異與甲硝唑耐藥有一定關(guān)系，但Hp對(duì)甲硝唑的耐藥機(jī)制目前尚未完全明確。細(xì)胞毒素相關(guān)基因A（cagA）編碼的產(chǎn)物是Hp重要的毒力因子，不僅與Hp致病及相關(guān)疾病臨床嚴(yán)重程度有關(guān)，還可能與甲硝唑的耐藥性有關(guān)，但是相關(guān)關(guān)系目前尚有分歧。由于基因本身的多態(tài)性和藥物選擇壓力下的遺傳多樣性，單純的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）難以完全闡明基因中的復(fù)雜信息。為了觀察DNA中堿基突變，本試驗(yàn)對(duì)從貴陽(yáng)某醫(yī)院60例消化內(nèi)科患者胃黏膜標(biāo)本中分離出的11株Hp的rdxA和cagA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株Hp26695堿基序列比對(duì)，探討二者堿基突變與甲硝唑耐藥性的關(guān)系。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Chem iDoc XRS凝膠儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Applied biosystems公司）；DNA提取試劑盒（北京天恩澤基因科技有限公司）。

1.2 試藥

哥倫比亞血瓊脂（英國(guó)Oxoid公司）；脫纖維羊血（廣州蕊特生物科技有限公司）；甲硝唑E試驗(yàn)（E-test）試紙條和微需氧袋（法國(guó)生物梅里埃公司）；萬(wàn)古霉素、兩性霉素、多粘霉素、三甲氧芐氨嘧啶（TMP）原料藥（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：V2002、A9528、S0414、T7883，純度均為：98%）。

1.3 菌株

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株Hp26695購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)教研室保存。Hp臨床分離株均分離自貴陽(yáng)某醫(yī)院60例消化內(nèi)科患者胃黏膜標(biāo)本。該60例患者因胃部不適行胃鏡檢查，標(biāo)本取自胃竇部或胃體部黏膜，并經(jīng)尿素碳（14C）呼氣試驗(yàn)陽(yáng)性鑒定后，進(jìn)行Hp的分離培養(yǎng)所得。

2 方法

2.1 分離培養(yǎng)

取胃黏膜標(biāo)本，接種于哥倫比亞血瓊脂平板，37℃微需氧袋培養(yǎng)72～96 h后，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢和過氧化氫酶、氧化酶、尿素碳（14C）呼氣試驗(yàn)均陽(yáng)性鑒定為Hp后，進(jìn)行增菌及傳代培養(yǎng)，－80℃保存。

2.2 藥敏試驗(yàn)

采用E-test法檢測(cè)Hp對(duì)甲硝唑的最低抑菌濃度（M IC）。將細(xì)菌制備成1×108cfu·m L－1濃度的菌液，均勻涂布于哥倫比亞血瓊脂平板上，貼上甲硝唑藥敏試紙條，37℃微需氧培養(yǎng)72 h。以M IC≥8 μg·m L－1判定為甲硝唑耐藥，M IC≥32 μg·m L－1判定為高水平甲硝唑耐藥，試驗(yàn)重復(fù)3次[4]。

2.3 Hp基因組DNA提取

按DNA提取試劑盒說明提取Hp基因組總DNA。用紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的DNA純度進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算260 nm和280 nm波長(zhǎng)處的光密度比值（OD260nm/OD280nm），當(dāng)比值≈1.8時(shí)，即認(rèn)為DNA純度較高[5]。

2.4 PCR擴(kuò)增

根據(jù)文獻(xiàn)[6]提供的引物序列合成特異性的引物，rdxA和cagA基因引物序列具體見表1。

表1 rdxA和cagA基因引物序列Tab 1 Primersof rdxA geneand cagA gene

采用PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μL，包括超純水19μL，上、下游引物各2μL，模板DNA 2μL，擴(kuò)增酶Primix Taq 25μL。cagA擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5m in，之后變性30 s，51～52℃褪火，72℃延伸2min，最終延伸10min。rdxA擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5m in，之后變性30 s，53.7℃褪火，72℃延伸2m in，最終延伸10m in。每次擴(kuò)增時(shí)均設(shè)標(biāo)準(zhǔn)株Hp26695作為陽(yáng)性對(duì)照，未加模板的PCR擴(kuò)增作為陰性對(duì)照。反應(yīng)完畢后取PCR產(chǎn)物2μL，置于1.0%瓊脂糖凝膠孔中電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

2.5 產(chǎn)物序列分析

將“2.4”項(xiàng)下得到的PCR產(chǎn)物送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件進(jìn)行堿基序列分析。

3 結(jié)果

3.1 Hp的培養(yǎng)與藥敏結(jié)果

從60例患者胃黏膜標(biāo)本中共分離出Hp臨床分離株11株。采用E-test法測(cè)定該11株Hp臨床菌對(duì)甲硝唑的M IC均≥256 μg·m L－1，表明其均為甲硝唑高耐藥株。

3.2 DNA提取結(jié)果

11株Hp臨床分離株與標(biāo)準(zhǔn)株Hp26695的DNA純度經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260nm/OD280nm均在1.75～1.8之間，表明其DNA純度均較高。

3.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

11株臨床分離株和標(biāo)準(zhǔn)株Hp26695的rdxA和cagA基因均分別在750 bp和260 bp位置出現(xiàn)特異性條帶，rdxA和cagA基因的擴(kuò)增率均為100%，具體擴(kuò)增電泳圖見圖1、圖2（圖中，陰：陰性對(duì)照，陽(yáng)：標(biāo)準(zhǔn)株Hp26695，M：marker）。

圖1 Hp臨床分離株的rdxA擴(kuò)增電泳圖Fig 1 Am p lified electrophorogram of rdxA gene of clinical isolated Hp

圖2 Hp臨床分離株的cagA擴(kuò)增電泳圖Fig 2 Am plified electrophorogram of cagA gene of Hp clinical isolated HP

3.4 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

11株Hp臨床分離株與標(biāo)準(zhǔn)株Hp26695相應(yīng)基因序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)：11株Hp臨床分離株均含有rdxA和cagA基因，其核苷酸同源性分別為95%～98%、86%～94%，2基因分別有4、10個(gè)規(guī)律性突變。11株臨床分離株rdxA和cagA基因的相同突變位點(diǎn)和突變形式見表2。

表2 11株Hp臨床分離株rdxA和cagA基因的相同突變位點(diǎn)和突變形式Tab 2 Samemutations sites and form of rdxA gene and cagA gene in 11 strainsof clinical isolated Hp

4 討論

甲硝唑是硝基咪唑類藥物，有較強(qiáng)的抗Hp活性，是三聯(lián)方案中最廣泛應(yīng)用的抗菌藥物之一。隨著抗菌藥物的廣泛使用，Hp對(duì)甲硝唑的耐藥率呈逐年上升趨勢(shì)，是導(dǎo)致含甲硝唑方案治療Hp感染失敗的主要原因。本試驗(yàn)從60例患者胃黏膜標(biāo)本分離出11株Hp，其cagA基因全部為陽(yáng)性，并且對(duì)甲硝唑的M IC均≥256μg·m L－1，表明全部為甲硝唑高耐藥株。

甲硝唑耐藥與rdxA基因有較為密切的關(guān)系。rdxA基因的插入、缺失導(dǎo)致下游翻譯終止密碼子的提前產(chǎn)生，rdxA蛋白合成提前終止；而堿基轉(zhuǎn)換、顛換突變直接導(dǎo)致氨基酸替換，這些突變均有可能導(dǎo)致rdxA蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，致使rdxA蛋白活性下降或失活而產(chǎn)生甲硝唑耐藥[7]。本研究中11株Hp臨床分離株均發(fā)生插入、缺失和堿基轉(zhuǎn)換3種突變類型，以堿基轉(zhuǎn)換為突變的主要類型，只出現(xiàn)單個(gè)堿基插入或缺失，未發(fā)現(xiàn)大片段序列插入或缺失，即均表現(xiàn)為點(diǎn)突變。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)rdxA基因變異位點(diǎn)大多不固定，但11株臨床分離株存在4個(gè)固定的突變位點(diǎn)，即均發(fā)生了1013598位點(diǎn)A→G、1013619位點(diǎn)G→A、1013961位點(diǎn)C→T、1014149位點(diǎn)A→G。這些位點(diǎn)的改變均未見文獻(xiàn)報(bào)道，筆者推測(cè)這些位點(diǎn)的突變與甲硝唑的耐藥可能有密切的關(guān)系，實(shí)際情況有待于增加臨床菌株數(shù)后再進(jìn)一步的證實(shí)。

Hp菌株的基因型不同是導(dǎo)致感染后臨床結(jié)果不同的重要因素之一。cagA基因是Hp重要的毒力因子，可以作為評(píng)價(jià)Hp毒力的指標(biāo)。研究[8]表明，Hp菌株中約有45%以上含有cagA基因，cagA陽(yáng)性患者的消化道潰瘍和胃癌的發(fā)生率明顯升高，并且cagA陽(yáng)性與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本試驗(yàn)11株Hp臨床分離株均擴(kuò)增出cagA基因，其與標(biāo)準(zhǔn)株Hp26695相應(yīng)基因序列相比同源性低于94%，序列間存在堿基的插入、缺失和替換。這可能與cagA基因的編碼區(qū)和非編碼區(qū)都存在多樣性有關(guān)。謝國(guó)艷等[6]報(bào)道Hp高耐藥菌中cagA陽(yáng)性菌株的rdxA基因突變率明顯高于cagA陰性菌株，并推測(cè)cagA陽(yáng)性Hp菌株的rdxA基因突變與甲硝唑產(chǎn)生高水平耐藥可能有一定關(guān)系。該報(bào)道和本研究結(jié)果有相似之處。

研究Hp對(duì)甲硝唑的耐藥機(jī)制為個(gè)體化用藥以及為選擇合適的抗菌藥物用于臨床治療奠定了基礎(chǔ)。本研究提示，Hp對(duì)甲硝唑耐藥性不僅可能與rdxA基因突變有關(guān)，亦可能與cagA基因相關(guān)。在后續(xù)的研究中，筆者將增加樣本量，運(yùn)用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。

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