38株多重耐藥鮑曼不動桿菌超廣譜酶基因的研究Δ

郭雷靜，李鑫，張淑芹，陸思靜#（.遼寧醫學院，遼寧錦州00；.遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州 00）

不動桿菌是常見的革蘭陰性桿菌之一，為重要的條件致病菌。近年來不動桿菌臨床標本分離率和耐藥率逐漸升高，其中最受關注的是鮑曼不動桿菌。2009年CHINET[1]數據顯示，鮑曼不動桿菌對β-內酰胺類抗生素特別是頭孢菌素類耐藥率均超過50%，分離率占革蘭陰性桿菌第4位；而北京協和醫院[2]鮑曼不動桿菌則超過銅綠假單胞菌上升到第2位，僅次于大腸埃希菌，對頭孢菌素類耐藥率均超過70%。我院2010年共檢測出鮑曼不動桿菌62株，其中多重耐藥鮑曼不動桿菌（MDRAB）為38株，占61.29%。目前國內、外多項研究表明，產超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）機制是細菌對頭孢菌素類抗生素耐藥最重要的原因之一。為了解我院MDRAB攜帶耐藥基因狀況，筆者對38株MDRAB進行了超廣譜酶基因檢測，為探討細菌耐藥機制及指導臨床合理應用抗生素提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2010年遼寧醫學院附屬第一醫院住院患者臨床標本不動桿菌共62株，篩選出MDRAB共38株，剔除同一患者相同部位重復分離株。38株MDRAB中，痰液17份，導管痰10份，分泌物3份，胸水、尿液及膿液各2份，血液、腦脊液各1份。

1.2 主要試劑與儀器

MicroScan WalkAway 40全自動微生物鑒定系統及其配套的鑒定藥敏復合板（美國Dade公司生產）；100 bp ladder DNA marker、瓊脂糖純化試劑盒、dNTP及Taq DNA聚合酶均為大連TaKaRa公司產品；多重聚合酶鏈反應（PCR）引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司生產；DNA Thermal Cycler 2400為美國Perkin Elmer公司產品。

1.3 藥敏試驗方法

采用微量稀釋法測定細菌對抗菌藥物的敏感性，根據美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）2007年版要求進行抗生素敏感性判斷，用WHONET 5.4軟件分析結果?？咕幬锲贩N分別為頭孢吡肟（FEP）、頭孢曲松（CRO）、頭孢噻肟（CTX）、頭孢他啶（CAZ）、氨芐西林/舒巴坦（SAM）、哌拉西林（PIP）、替卡西林/克拉維酸（TCC）、復方磺胺甲唑（SXT）、環丙沙星（CIP）、左氧氟沙星（LVX）、亞胺培南（IPM）、慶大霉素（GEN）、妥布霉素（TOB）、阿米卡星（KAN）。標準質控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853，大腸埃希菌ATCC 25922。

1.4 超廣譜酶基因的PCR檢測及DNA測序分析

從LB培養基上挑取單個受試菌落加入5 mL LB培養液中，37 ℃、200 r·min－1震蕩孵育16～20 h。取1.5 mL菌液12 000 r·min－1離心5 min，棄去上清，加入80 μL蒸餾水混勻，95 ℃加熱10 min后12 000 r·min－1離心5 min，取上清2 μL作ESBLs基因檢測的模板。

引物序列出處及反應條件見表1。

表1 PCR引物序列和產物長度Tab 1 Sequence of PCR primer and the length of products

PCR擴增體系均為25 μL，每個體系中包含：（1）10×loading buffer 2.5 μL；（2）20μmol·L－1的引物各 0.5 μL；（3）1.25 U的 TaqDNA 聚合酶；（4）模板 2 μL；（5）濃度為 10 μmol·L－1dNTP各 0.5 μL，最后加滅菌去離子水至25 μL。

在紫外燈下觀察擴增PCR產物在2%瓊脂糖凝膠電泳中的分析結果，出現明亮目的條帶者為陽性。陽性條帶行切膠純化后送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序，登陸GenBank用Blast程序分析、比對。

2 結果

2.1 科室分布

MDRAB在重癥監護室（ICU）檢出率最高，其次為呼吸科和神經外科，感染部位以呼吸道和手術切口為最高，分別為67.5%和17.5%。該菌在不同科室的分布見表2。

表2 38株MDRAB分布株數和百分率Tab 2 Number and percentage of 38 strains of multidrug resistantA.baumannii

圖1 TEM基因PCR結果電泳圖M.100 bp ladder DNAmarker；N.陰性對照；1～6.WSW01～06Fig 1 Electrophoretogram of PCR product of TEMM.100 bp ladder DNAmarker；N.negative control；1～6.WSW01～06

圖2 PER-1基因和SHV基因PCR電泳圖M.100 bp ladder DNAmarker；1.WSW30；2～6.WSW32，35～38Fig 2 Electrophoretogram of PCR product of PER-1 and SHVM.100 bp ladder DNAmarker；1.WSW30；2～6.WSW32，35～38

2.2 對14種抗生素耐藥性

38株MDRAB對14種抗生素的耐藥結果及超廣譜酶基因檢測結果見表3。

2.3 耐藥基因陽性結果及測序后結果

38株MDRAB中TEM基因陽性33株（86.84%，圖1為部分結果），PER-1基因陽性5株（13.16%）、SHV基因陽性1株（2.63%）（見圖2）。其中，5株TEM、PER-1基因均陽性，占13.16%；1株TEM、SHV基因均陽性，占2.63%。取TEM、PER-1和SHV基因所有陽性產物純化并送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序，結果和GenBank上報道的已知序列相比對，證實為TEM、PER-1和SHV，同源性均為99%。

3 討論

我院分離的38株MDRAB占所有不動桿菌（62株）的61.29%，高于2009年[1]CHINET細菌檢測數據的44%。我院的ICU為綜合ICU，同時收住呼吸、神經外科和骨創外科等危重癥病人，好轉后再轉到相應科室，加上包括呼吸機在內的有創性治療措施的廣泛應用，此為MDRAB的傳播和流行提供了很好的機會。因此，加強醫院管理，積極有效地控制鮑曼不動桿菌感染和傳播是極其重要的。

本研究顯示，38株菌全部符合多重耐藥不動桿菌（對以下3種或3種以上抗生素耐藥：頭孢菌素類、碳青霉烯類、含β-內酰胺酶抑制劑的復合制劑、氟喹諾酮類及氨基糖苷類抗生素）標準。由表3可見，對阿米卡星敏感率為15.79%（6株），耐藥率為84.21%（32株）；對妥布霉素敏感率為13.16%（5株），耐藥率86.84%（33株）；對頭孢他啶、替卡西林/克拉維酸耐藥率均為92.11%（35株），僅7.89%（3株）對頭孢他啶敏感，但對替卡西林/克拉維酸為中介（7.89%），無敏感菌株。對其余9種抗生素包括頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢噻肟耐藥率均為100%，無敏感菌株。其中的30株菌對14種抗生素全部耐藥，導致幾乎無藥可選。而且相對敏感的氨基糖苷類抗生素因副作用及短期內極易產生耐藥性限制了其在臨床的長期、廣泛應用。對于感染MDRAB的患者，其治療費用及死亡率勢必增加，預后極差。

本研究中38株MDRAB中33株均產生TEM型β-內酰胺酶。近年來國內在鮑曼不動桿菌中已經檢測到了TEM、CTX、SHV、PER-1、VEB、GES等基因，但仍以TEM和PER-1檢出率最高。TEM是革蘭陰性桿菌中最常見耐藥基因，可使細菌對青霉素和第3、4代頭孢菌素以及單環類抗生素耐藥，但對頭霉素及碳青霉烯類抗生素敏感。PER-1在鮑曼不動桿菌中檢出的報道日益增多，其既可為質粒編碼又可為染色體編碼，在上游存在插入序列ISPa12，此序列可能與提高其表達有關[6]。PER-1可以水解廣譜頭孢菌素、頭孢哌酮/舒巴坦及氨芐西林/舒巴坦，但不水解或較弱水解亞胺培南和美羅培南。此外，PER-1還可以導致對氨基糖苷類抗生素的耐藥，如慶大霉素及阿米卡星，因此也更有力地表明了多重耐藥的存在。國外也有大量PER-1的報道，特別是在韓國、土耳其非常流行，也見于法國、比利時和玻利維亞[7，8]。國內也有多家醫院報道了PER-1基因的存在；PER-2在阿根廷、美國也有報道。本研究中發現了1株攜帶SHV基因的耐藥菌株，在我國北京、廣州、福州等[9]地區也發現了SHV的鮑曼不動桿菌。雖然SHV基因不是我院的鮑曼不動桿菌多重耐藥最主要的原因，但也要引起警惕。發現5株同時攜帶TEM和PER-1基因，1株同時攜帶TEM和SHV，應密切觀察和監控這樣的危險菌株，防止其在院內暴發和流行。

本研究中有5株MDRAB的PCR擴增產物均為陰性，一方面是由于未對所有的耐藥基因進行檢測；另一方面細菌耐藥機制除產超廣譜酶基因酶以外，還同時存在著產其他β-內酰胺酶如Ampc酶、青霉素結合蛋白親和力下降、外膜孔蛋白（OprD）缺失及主動外排泵等其他的耐藥機制。目前認為，整合子不僅可以介導細菌耐藥性聚集導致多重耐藥產生，而且可以在不同遺傳物質和菌株間轉移，這些將有待于進一步研究。

表3 38株MDRAB藥物耐藥性及超廣譜酶基因檢測結果Tab 3 Drug resistance and extented-specturm β-lactamase genes of 38 strains of multidrug resistantA.baumannii

[1]張小江，徐英春，俞云松，等.2009年中國CHINET鮑曼不動桿菌細菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志，2010，10（6）：441.

[2]王 賀，張小江，劉文靜，等.2009年北京協和醫院細菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志，2011，11（3）：161.

[3]Jones CH，Tuckman M，Keeney D，et al.Characterization and sequence analysis of extended-spectrumβ-lactamaseencoding genes from Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae，and Proteus mirabilis isolates collected during tigecycline phase 3 clinical trials[J].Antimicrob Agents Chemother，2009，53（2）：465.

[4]Lim KT，Yasin R，Yeo CC，et al.Characterization of multidrug resistant ESBL-producing Escherichia coli isolates from hospitals in Malaysis[J].J Biomed Biotechnol，2009：ID165637.

[5]陳童恩，許小敏，劉 鵬，等.ICU泛耐藥鮑曼不動桿菌分離株相關耐藥基因檢測[J].現代實用醫學，2009，21（1）：47.

[6]Pasteran F，Rapoport M，Petroni A，et al.Emergence of PER-2 and VEB-1a in Acinetobacter baumannii strains in the Americas[J].Antimicrob Agents Chemother，2006，50（9）：3 222.

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[8]Naas T ，Bogaerts P，Bauraing C，et al.Emergence of PER and VEB extended-spectrum beta-lactamases in Acinetobacter baumannii in Belgium[J].J Antimicrob Chemother，2006，58（1）：178.