鹽酸多巴酚丁胺注射液細菌內毒素檢查法的建立

李逢春，李震（1.河南省食品藥品檢驗所，鄭州450003；.河南南陽市中心醫院，河南南陽473000）

鹽酸多巴酚丁胺注射液適用于器質性心臟病時心肌收縮力下降而引起的心力衰竭，包括心臟直視手術后所致的低排血量綜合征作為短期支持治療使用；其可對心肌產生正性肌力作用，主要作用于β1受體，對α及β2受體作用相對較小，臨床應用比較廣泛。在《中國藥典》2005年版二部收載的質量標準[1]中，該品種項下無熱原檢查項，為了避免臨床輸液因細菌內毒素污染引起發熱、寒戰、昏迷甚至死亡等輸液反應，在《中國藥典》2010年版中加強了對該品種的質量控制，增加了細菌內毒素的檢查項[2]。為此，筆者采用鱟試劑（TAL）法對鹽酸多巴酚丁胺注射液中細菌內毒素檢查的可行性進行了研究。

1 儀器與試藥

DC-3A型干式恒溫器（南京三愛斯技術開發有限公司）。

鹽酸多巴酚丁胺注射液（浙江瑞新藥業股份有限公司，批號：20090312；上海第一生化藥業有限公司，批號：090501；廣東南國藥業有限公司，批號：090407；山東方明藥業股份有限公司，批號：0907022。以上各廠家產品規格均為20 mg∶2 mL）；TAL（湛江安度斯生物有限公司，批號：0710262，靈敏度：0.5 EU·mL－1；批號：0902132，靈敏度：0.125 EU·mL－1。福州新北生化工業有限公司，批號：08020912，靈敏度：0.5 EU·mL－1。湛江博康海洋生物有限公司，批號：0901122，靈敏度：0.125 EU·mL－1。以上各廠家產品規格均為每支0.5 mL）；細菌內毒素工作標準品（WSE，批號：150601-200862，效價：每支120 EU）、細菌內毒素檢查用水（BET水，批號：W2008-4，規格：每支10 mL）均由中國食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結果

2.1 TAL標示靈敏度（λ）的復核

依法[1]對試驗用的TAL進行靈敏度復核。結果，4批TAL靈敏度測試值（λc）均在0.5λ～2.0λ之間，表明靈敏度符合規定，可用于試驗。

2.2 樣品內毒素限值（L）的確定

按照《中國藥典》相關方法[1]，根據公式L＝K/M確立：K為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑K＝5 EU·kg－1·h－1；M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量。參照該品種藥品說明書及《臨床用藥須知》[1，3]，該品種成人常用量為250 mg，人均體重按60 kg計，一般加入到5%葡萄糖注射液中，滴注速度2.5～10 μg·kg－1·min－1，考慮到其是用于休克的心血管活性藥物，標準從嚴，滴注時間按1 h來計算，故M＝250 mg·60 kg－1·h－1＝4.2 mg·kg－1·h－1，則L＝1.2 EU·mg－1。

2.3 樣品預干擾試驗

采用靈敏度（λ）為0.5 EU·mL－1的TAL，則樣品的最大有效稀釋倍數（MVD）＝cL/λ＝24倍，采用不超過MVD即3、6、12、24倍的溶液（濃度分別為3.3、1.7、0.8、0.4 mg·mL－1）作為供試品管（NPC）系列溶液，根據使用TAL的靈敏度，在其中分別加入2λ的細菌內毒素，制成樣品陽性溶液作為PPC系列溶液。用λ＝0.5 EU·mL－1的TAL，分別與4個系列溶液反應，各重復2管，同時作陰性對照（NC）和陽性對照（PC）各2管，做2個批號樣品預干擾試驗[1，4]。結果見表1（注：表中“+”表示TAL安瓿從恒溫箱中輕輕取出，緩緩倒轉180°，所形成凝膠不變形，不滑脫；“-”表示未形成凝膠或凝膠不堅實，變形并滑脫）。

表1 預干擾試驗結果Tab 1 Results of preliminary interference test

2.4 樣品正式干擾試驗

使用2個批號的TAL，對4批鹽酸多巴酚丁胺注射液進行12倍稀釋（0.8 mg·mL－1）作正式干擾試驗[1，4]，得到Es（BET水制成的內毒素溶液的反應終點濃度的幾何平均值）和Et（供試品溶液制成的內毒素溶液的反應終點濃度幾何平均值）值，結果見表2。

表2 干擾試驗結果Tab 2 Results of interference test

由表2結果可見，4批鹽酸多巴酚丁胺注射液的12倍稀釋液（0.8 mg·mL－1）對2個廠家的TAL干擾試驗結果為：Es在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）范圍內，Et在0.5Es～2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）范圍內，說明該樣品進行12倍稀釋后確已排除干擾作用。

2.5 樣品細菌內毒素檢查

取4批樣品，采用λ為0.125 EU·mL－1的TAL，以L為1.2 EU·mg－1作為結論評定標準，依法[1]進行操作和結果判斷，詳見表3。

表3 4批樣品的細菌內毒素檢查結果Tab 3 Results of endotoxin detection of 4 batches of sample

由表3結果顯示，4批鹽酸多巴酚丁胺注射液采用2個廠家TAL作細菌內毒素檢查[1]，結果均小于限值（1.2 EU·mg－1），說明可用此限值進行該樣品細菌內毒素檢查。

3 討論

細菌內毒素檢查法與家兔熱原檢查法比較，有勞動強度低、快捷、經濟、靈敏和易于標準化等優點，比家兔法更適應現代醫藥工業的發展。因此，《中國藥典》自1990年版開始收載該法以來，運用細菌內毒素檢查法品種逐步增多。

細菌內毒素檢查法機制涉及一種復雜的酶促反應過程，因為細菌內毒素是親水與疏水雙重活性的兩性分子，其主要毒性部位是類脂A端，溶解過程如不劇烈振蕩，疏水性的類脂A端極易與試管壁接觸而不能與TAL充分接觸，在試驗中會造成假陰性的結果，所以，在內毒素的溶解稀釋過程中，每一步應嚴格按要求在旋渦混合器上充分振搖。

由試驗結果表明，鹽酸多巴酚丁胺注射液稀釋到0.8 mg·mL－1濃度時對TAL和細菌內毒素的反應沒有干擾作用。因此，本品采用限值1.2 EU·mg－1進行細菌內毒素檢查是可行的。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：附錄ⅪE.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：690.

[3]國家藥典委員會.臨床用藥須知（化學藥和生物制品卷）[S].北京：化學工業出版社，2005：178.

[4]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范[M].北京：中國醫藥科技出版社，2005：287.