HPLC法同時測定咖啡酸片的主藥和有關(guān)物質(zhì)含量

張雪玲，于曉秋，王穎，邵海云，張吉娟，徐謙，賈首時（.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院藥劑科，黑龍江齊齊哈爾 6006；.齊齊哈爾市第一醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 6005；.齊齊哈爾市藥品檢驗所，黑龍江齊齊哈爾 6006）

咖啡酸為止血、生白細(xì)胞藥，能收縮增固微血管，促進(jìn)凝血因子功能，升高白血球及血小板數(shù)量，用于白細(xì)胞、血小板減少癥的治療。咖啡酸片是其臨床應(yīng)用主要制劑，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》（化學(xué)藥品及制劑第一冊）[1]中。咖啡酸原料藥為源植物提取，常用提取源植物包括牽牛子、蒲公英、山楂、纈草、麝香草、杜仲等。其主成分提取通常采用水煮提取法、水煮醇沉法、70%乙醇回流提取法、水提石灰沉淀提取法等。由于提取工藝的不同，提取過程中難免存在部分植物來源的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、黏液質(zhì)、皂苷、鞣質(zhì)等溶入提取液中，很難除去。在乙醇精制中，雜質(zhì)會隨咖啡酸提取液一起析出，所以很有必要增加咖啡酸片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢查項下有關(guān)物質(zhì)考察項。文獻(xiàn)[1]檢查項下沒有有關(guān)物質(zhì)的檢查，含量項下采用紫外法檢測含量。本試驗建立的高效液相色譜（HPLC）法則可同時測定咖啡酸片中主藥和有關(guān)物質(zhì)的含量，操作簡便、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，可有效地控制該制劑的產(chǎn)品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1100 HPLC儀（美國Agilent公司）；G1314A VWD紫外檢測器、UV-2550紫外分光光度計（日本島津公司）。

咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110885-200102，供含量測定用）；咖啡酸片（山東省德州制藥廠，批號：20100201、20100611、20100616，規(guī)格：每片0.1 g）；甲醇、乙醇為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果[1，2]

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamosil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.15%磷酸二氫鈉緩沖液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.0）＝23∶77，流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：323 nm；柱溫：30 ℃。

2.2 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗

2.2.1 破壞試驗。精密稱取樣品粉末（相當(dāng)于咖啡酸10 mg的細(xì)粉，置于100 mL容量瓶中），加乙醇溶解、過濾、稀釋、定容，制備成0.1 mg·mL－1的供試品溶液5份；取1份置于4 500 lx的光照箱內(nèi)光照48 h；另取供試品溶液1份置于70℃烘箱中放置2 h；再取供試品溶液3份各100 mL，分別加入1 mol·L－1氫氧化鈉溶液、1 mol·L－1鹽酸溶液和3%過氧化氫溶液各2 mL，加熱回流1 h，冷至室溫，再分別用1 mol·L－1鹽酸溶液和1 mol·L－1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7。精密量取上述5種溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的3倍。結(jié)果表明，供試品溶液在高溫條件下穩(wěn)定，在酸、堿、光照條件下略有降解，在氧化條件下不穩(wěn)定，完全分解，并且各破壞條件下的降解產(chǎn)物與主峰可達(dá)到有效分離，詳見圖1。

2.2.2 輔料干擾試驗。按照處方比例，加入除咖啡酸原料藥外所有輔料制備成輔料溶液（稱取輔料約相當(dāng)于樣品平均片重的1/10，置于100 mL容量瓶中，加乙醇溶解，過濾，稀釋，定容，即得），進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果顯示該制劑輔料峰與主峰可達(dá)到有效分離，對測定無干擾，詳見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取標(biāo)準(zhǔn)品100.76 mg置于100 mL容量瓶中，加乙醇溶解稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。精密量取貯備液0.5、1、2、4、6、8、10 mL置于100 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度。精密量取上述溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)作線性回歸，結(jié)果，回歸方程為：Y＝1 202.8X－32.5（r＝0.999 7）。表明咖啡酸檢測濃度線性范圍為5.038～100.76 μg·mL－1。

圖1 高效液相色譜圖A.樣品；B.標(biāo)準(zhǔn)品；C.輔料；D.酸破壞后樣品；E.堿破壞后樣品；F.光照破壞后樣品；G.氧化破壞后樣品；H.高溫破壞后樣品；1.咖啡酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.sample；B.reference substance；C.excipient；D.samples destroyed by acid；E.samples destroyed by alkali；F.samples destroyed by light；G.samples destroyed by H2O2；H.samples destroyed by heat；1.caffeic acid

2.4 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的供試品（批號：20100201）細(xì)粉適量（約相當(dāng)于咖啡酸100 mg），共9份，分別置于200 mL容量瓶中，精密加入“2.3”項下貯備液（相當(dāng)于供試品中已知含量的80%、100%、120%各3份，精密量取貯備液80 mL 3份、100 mL 3份、120 mL 3份）置于上述裝有9份200 mL供試品溶液的容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，過濾；再分別精密量取2 mL續(xù)濾液置于100 mL容量瓶中，加流動相至刻度，按“2.9.1”項下方法測定，計算回收率，得平均回收率為99.04%，RSD＝0.17%，結(jié)果詳見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果Tab 1 Results of recovery tests

2.5 檢測限和定量限

取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液用流動相逐級稀釋，信噪比（S/N）為3∶1時測得最低檢測限為16.7 ng·mL－1；信噪比（S/N）為10∶1時定量限為85.3 ng·mL－1。

表2 樣品中主藥及有關(guān)物質(zhì)含量測定結(jié)果（%）Tab 2 Content determination results of main component and related substances of samples（%）

2.6 重復(fù)性試驗

精密稱取供試品（批號：20100201）6份，按照“2.9.1”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計算樣品的平均含量為101.6%，RSD＝0.56%。

2.7 精密度試驗

選取“2.3”項下高、中、低3種濃度溶液，分別重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果表明方法精密度良好，RSD分別為0.56%、0.48%、0.57%。說明本試驗所采用色譜系統(tǒng)及方法可靠、耐用。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一批供試品（批號：20100201）溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別在0、4、8、12、24 h時進(jìn)樣測定。結(jié)果，各時間內(nèi)2種溶液的主峰峰面積值基本保持不變，供試品溶液RSD＝0.64%，標(biāo)準(zhǔn)品溶液RSD＝0.82%，表明制備的溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.9 樣品中主藥及有關(guān)物質(zhì)含量測定[2，3]

2.9.1 主藥含量測定。精密稱取樣品粉末（約相當(dāng)于咖啡酸100 mg）置于100 mL容量瓶，加乙醇溶解并稀釋至刻度，濾過；精密量取續(xù)慮液1 mL置于100 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得，作為含量測定供試品溶液。稱取咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品適量（精密稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL容量瓶中，乙醇溶解稀釋定容后，精密量取10 mL置于100 mL容量瓶中，乙醇定容），加乙醇制成0.01 mg·mL－1的溶液，作為含量測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密量取上述2種溶液各20 μL，注入液相色譜儀，按外標(biāo)法計算，即得。并將該結(jié)果與文獻(xiàn)[1]方法測定的結(jié)果比較，結(jié)果見表2。

2.9.2 有關(guān)物質(zhì)。精密量取“2.2.1”項下供試品溶液1 mL置于100 mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，加流動相制成0.001 mg·mL－1的溶液，作為有關(guān)物質(zhì)測定對照溶液。取對照溶液20 μL，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰為滿量程的20%～25%，再精密量取“2.2.1”項下供試品溶液和本項下對照溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的3倍。供試品溶液如有雜質(zhì)峰，按主成分自身對照法計算雜質(zhì)總量，各雜質(zhì)峰（色譜圖上除溶劑、輔料峰以外）的面積之和不得大于對照溶液主峰面積（1.5%），測定結(jié)果見表2。

3 討論

文獻(xiàn)[1]含量測定方法為紫外法，檢測波長為（323±1）nm；筆者取用流動相稀釋后的對照品溶液在紫外分光光度計上檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在323 nm波長處有最大吸收，因此檢測波長定為323 nm，與文獻(xiàn)吻合；另將有關(guān)物質(zhì)限度定為1.5%。

本試驗建立了可以同時測定咖啡酸片中主藥和有關(guān)物質(zhì)含量的HPLC法，測定結(jié)果表明所建立的方法可以將主藥與輔料及其雜質(zhì)分離，能夠排除有關(guān)物質(zhì)的干擾，專屬性較強(qiáng)。本方法與文獻(xiàn)相比，不但大大提高了檢測靈敏度，操作簡單，而且新增有關(guān)物質(zhì)考察項，能更好地控制制劑質(zhì)量。

[1]國家藥典委員會.衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)（化學(xué)藥品及制劑第一冊）[S].1989：70-71.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅤD.

[3]張慶合.高效液相實(shí)用手冊[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：181-209.