正交試驗優化復方奧硝唑陰道生物黏附膜處方

王利，王法琴，王立宏，劉銘佩，焦海勝（.蘭州大學第二醫院藥劑科，蘭州730030；.甘肅武威市醫院，甘肅武威 733000）

奧硝唑（Ornidaole）是新一代的硝基咪唑類衍生物，具有良好的抗厭氧菌和抗滴蟲作用，用于治療急性厭氧菌感染和滴蟲陰道炎，具有療效確切、不良反應小的特點。鹽酸環丙沙星（CPF）是第3代喹諾酮類抗菌藥，具有抗菌譜廣、殺菌作用強等特點，尤其對需氧革蘭陰性桿菌的抗菌活性高，對多重耐藥菌也具有抗菌活性。以上2種藥物合用能有效治療陰道滴蟲、厭氧菌感染和細菌性陰道炎。

生物黏附釋藥系統是指合成的或天然的大分子親水凝膠黏附于生物組織上的一種釋藥系統。選擇適當的黏附劑，增加藥物與黏膜表面的接觸時間和接觸密度可以控制釋藥速度和吸收量。可作黏附材料的有天然或合成的聚合物：Carbolpol（CP）、聚乙烯醇（PVA）、羧甲基纖維素（CMC）、乙基纖維素（EC）、羥丙基纖維素（HPC）、羥丙基甲基纖維素（HPMC）、殼聚糖、海藻酸鈉、聚乙二醇（PEG）等[1]。殼聚糖或其衍生物是一種堿性天然多糖，含有游離的氨基，可通過體內的水解或酶解反應，最終降解為無毒的產物，被人體吸收或排出體外，具有良好的生物相容性和生物可降解性，且具有生物黏附性和多種生物活性，能有效增加藥物通過眼部、鼻腔及胃腸道黏膜上皮的吸收，降低藥物的吸收前代謝，提高藥物的生物利用

＊副主任藥師。研究方向：藥物新制劑及質量標準。電話：0931-8942491。E-mail：WangLi2720@163.com度[2]。殼聚糖陰道生物黏附膜是以殼聚糖為主要黏附材料，將主藥溶解后加入鑄膜液制成的局部應用于陰道黏膜而緩慢釋放藥物的一種生物黏附藥物傳輸系統[3]，可以減少用藥次數，降低毒副作用。由于采用了殼聚糖、明膠等生物黏附材料作為膜劑載體，因而所制生物黏附膜具有緩釋、靶向作用[4]。為了考察生物黏附膜的主要成分對其黏附力及成膜性能的影響，本研究以加入奧硝唑和CPF后的陰道生物黏附膜的處方為對象，采用L9（34）正交設計對其進行優化。

1 儀器與材料

1200型高效液相色譜（HPLC）儀，包括G1311A型液相色譜泵、G1314B紫外檢測器、安捷倫色譜工作站（美國Agilent公司）；ME215S電子分析天平（德國賽多利斯儀器系統有公司）；HJ-4A磁力加熱攪拌器（江蘇省金壇市晶玻實驗儀器廠）；HH-S電熱恒溫水浴鍋（江蘇省醫療器械廠）；pHS-25數字式pH計（上海雷磁儀器廠）。

奧硝唑（湖南九典制藥有限公司，批號：20050121，純度：99.41%）；CPF（浙江新華制藥有限公司，批號：20090403，純度：99.36%）；殼聚糖（浙江金殼生物化學有限公司，脫乙酰度：≥85%）；PVA（天津市光復精細化工研究所，聚合度：1 750±50）；試驗中所用水為純化水，乙腈為色譜純；復方奧硝唑陰道生物黏附膜（蘭州大學第二醫院藥劑科研制，每張膜含CPF 0.008 g、奧硝唑0.008 g；規格：2.0 cm×2.0 cm）。

實驗動物：成熟健康家兔，♀，5～6月齡，由蘭州生物制品研究所提供，合格證書：醫動字第14-009號。

2 方法與結果

2.1 處方

奧硝唑10 g，CPF 10 g，殼聚糖20 g，明膠10 g，PVA10 g，甘油適量，加蒸餾水至1 000 g。

2.2 藥膜的制備

稱取適量殼聚糖溶于4%冰乙酸水溶液中，制備成適宜濃度的殼聚糖溶液，過濾，備用；將奧硝唑和CPF均勻分散在水溶液中，置于水浴中加熱溶解。將適量PVA和明膠分別制備成適宜濃度，置于水浴70℃中溶解后加入殼聚糖溶液中，攪勻，再加入已溶解的藥物，置于磁力攪拌器上攪拌，最后加入一定量的甘油，混勻，靜置脫泡，得到鑄膜液。取鑄膜液4 mL，用流涎法鋪于7.5 cm×2.5 cm玻璃板上，室溫下自然干燥，分割成2.0 cm×2.0 cm的正方形膜，每貼藥膜重約0.16 g，含藥量為：奧硝唑0.008 g，CPF 0.008 g，包裝，即得。

2.3 正交試驗設計

圖1 生物黏附力測定裝置圖示Fig 1 Device for determination of vertical adhesive force

2.3.1 生物黏附力的測定[5]。生物黏附力的測定裝置見圖1。圖1中，A為鐵架臺，B為一可控流速輸液裝置，a和b為大小相等的帶掛鉤的硬塑料板（a和b板上均固定有面積為2.0 cm×2.0 cm的新鮮家兔陰道組織，該組織以模擬陰道液[6]洗凈表面雜質，并保持黏膜黏液凝膠層的完整），C為液體收集裝置。

測定方法：取面積為1.0 cm×1.0 cm的供試膜置于人工陰道液20 mL（pH 4.2）中浸潤5 min，取出，用濾紙吸去表面溶液，平鋪于b板上的陰道組織中央，迅速壓上a板，用50 g砝碼施壓5 min，移去砝碼，用裝置B向C中勻速滴加水，至a與b完全脫離。稱取b板、掛鉤、C及C中水的總重量M，按下式計算供試膜單位面積上生物黏附力的大小。生物黏附力＝M×g（g＝9.8 N·kg－1）。

2.3.2 正交試驗設計。在預試驗的基礎上，選擇對生物黏附膜影響顯著的4個因素為考察對象，即殼聚糖濃度（A）、明膠濃度（B）、PVA濃度（C）和主藥（2種主藥之和）濃度（D），每個因素取3個水平，按L9（34）進行試驗，以藥膜的生物黏附力作為考察指標，對處方進行優選。因素水平見表1。

表1 因素水平表Tab 1 Factors and levels

2.3.3 正交試驗結果及處方優化。正交試驗結果及方差分析見表2、表3。

表2 正交試驗結果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析結果Tab 3 Results of variance analysis

對表2進行直觀分析可知，各因素的影響大小順序為：A＞D＞B＞C，優選的最佳條件為A3B3C2D2，即殼聚糖濃度為2.0%，明膠濃度為2.0%，PVA濃度為1.0%，主藥濃度為2.0%。方差分析結果顯示，殼聚糖濃度是最主要的影響因素。由于明膠濃度為非主要影響因素，同時參考單因素試驗結果，選擇1.0%明膠，使溶解主藥的水量增加，以得到透明的藥膜。故最終優選的處方為殼聚糖濃度為2.0%，明膠濃度為1.0%，PVA濃度1.0%，主藥濃度為2.0%。

2.3.4 處方驗證。根據正交試驗結果，按照優選的處方比例制備3批樣品，進行處方驗證，結果表明以該處方制備的含藥陰道生物黏附膜的單位生物黏附力均大于2.0 N·cm－2，說明處方可行。

2.4 體外釋放度的測定

2.4.1 色譜條件。色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.3%磷酸溶液（三乙胺調pH至2.5）＝19∶81（V/V），流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：286 nm；進樣量：5 μL；柱溫：30 ℃。

2.4.2 標準曲線的制備。精密稱取CPF 27 mg、奧硝唑26.5 mg，置于同一50 mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容得標準貯備溶液。分別精密吸取上述2種溶液各0.5、1.0、1.5、2.5、5.0 mL，置于同一10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制備成系列濃度溶液，同時與標準貯備液在上述色譜條件下進樣測定。以峰面積（Y）為縱坐標，濃度（X）為橫坐標，得到CPF的標準曲線回歸方程為Y＝0.045 8X－1.562 1（r＝0.999 9）；奧硝唑的標準曲線回歸方程為Y＝0.181X+0.808 6（r＝0.999 9）。結果，CPF、奧硝唑檢測濃度線性范圍分別為27～540 mg·L－1、26.5～530 mg·L－1；高、中、低3種濃度的日內、日間RSD均小于2.0%；平均回收率分別為99.52%（RSD＝1.03%）、97.98%（RSD＝0.41%）。

2.4.3 體外釋放度的測定[7]。取復方奧硝唑陰道生物黏附膜（7.5 cm×2.5 cm），精密稱定，按轉籃法（《中國藥典》2005年版二部附錄ⅩD）[8]測定累積釋放率，以模擬陰道液[6]250 mL為釋放介質，轉速100 r·min－1，溫度為（37±0.5）℃，分別于30 min和1、2、8、12 h定時取樣，每次2.0 mL，同時補充2.0 mL新鮮介質，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，進樣，記錄色譜圖并計算累積釋放率。

復方奧硝唑陰道生物黏附膜的體外釋放曲線見圖2。

圖2 復方奧硝唑陰道生物黏附膜體外釋放曲線（n＝3）Fig 2 In vitro release profile of Compound ornidazole chitosan vaginal bioadhesive film（n＝3）

由圖2可見，CPF開始有突釋現象，30 min內累積釋放率達46.81%，而后釋放曲線趨于平緩，12 h累積釋放率為89.11%。奧硝唑釋放較CPF快，30 min內累積釋放率達62.99%，12 h累積釋放率為97.18%。2種主藥的累積釋放率考察結果表明，所制復方奧硝唑陰道生物黏附膜具有較好的藥物釋放性能，并具有緩釋作用。

3 討論

本試驗以殼聚糖為主要載體制備了復方奧硝唑陰道生物黏附膜。該膜劑通過陰道黏膜局部用藥，可避免肝臟首關作用和胃腸道生理關卡效應，提高藥物生物利用度，減少用藥劑量，增強臨床療效，減少不良反應，同時具有緩慢持久釋放藥物的特性。本文所用殼聚糖為酸性殼聚糖，其分子中含有羥基和氨基，化學活性與甲殼素相比大大加強，而且溶解度也增大，不溶于水和堿溶液，可溶于稀酸，溶于稀酸時呈黏稠狀，在稀酸溶液中，殼聚糖中的β-（1，4）糖苷鍵也會緩慢水解，黏度逐漸下降，因此使用時應該現配現用。考慮到陰道內溶液的pH呈酸性（4.2左右），并且體積有限，本試驗選用酸性殼聚糖為主要膜材，以4%冰醋酸溶解后鑄膜液pH在4.5左右，與生理環境pH接近，以利于藥物的溶解吸收。

在試驗中發現，當鑄膜液中藥物濃度超過3%時，干燥后，藥物析出使得藥膜會產生明顯的淡黃色沉淀物，故主藥濃度實為2.0%。膜在陰道中的溶脹主要與明膠、甘油和PVA等水溶性成分有關。試驗結果表明，在（37±0.5）℃的水浴條件下，藥膜在pH值4.5的模擬陰道液中溶脹度較水中大，故選擇釋放介質為模擬陰道液。

影響膜中藥物釋放的因素除主要有藥物的溶解度、環境的pH值、膜在模擬陰道液中的溶脹程度外，膜的厚度也是影響釋放的因素之一。本試驗采用流涎法鋪膜，制備過程中固定了鋪制每張膜的鑄膜液的體積和玻璃板的大小。即在鑄膜液按“2.2”項下方法制成后，每次取一定體積（4 mL）的鑄膜液鋪于面積為18.75 cm－2的玻璃板上，以此來控制膜的厚度和每張膜中藥物的量。一般認為膜厚增加，藥物釋放變慢。另外，膜的大小對藥物的釋放影響較小，因此主要考慮每張膜的載藥量能達到治療的需要即可。

2種主藥的體外釋放度考察結果表明，在釋放30 min內有突釋現象，可能是由于黏附在膜表面的CPF和奧硝唑較多，且2種主藥在37℃的釋放介質中溶解度較大造成的。藥膜在黏附于陰道黏膜后，可在患病局部快速達到治療濃度，以高濃度殺滅致病菌，而后緩慢釋放12 h，達到提高療效、減少劑量、降低全身性副作用的目的。

[1]唐 倩，袁擁華，謝慶娟.生物黏附傳遞系統進展概況[J].現代醫藥衛生，2007，23（23）：3 531.

[2]Park JH，Saravanakumar G，Kim K，et al.Targeted delivery of low molecular drugs using chitosan and its derivatives[J].Advanced Drug Delivery Reviews，2010，62（1）：28.

[3]Justintemu M，Damian F，Kinget R，et al.Intravaginal gels as drug delivery system[J].Journal of Women’s Health，2004，13（7）：834.

[4]鄒 陽，黃 華.制霉菌素口腔粘附片的研制及粘附性考察[J].中國藥房，2006，17（11）：815.

[5]李華凌，陳海燕，于 輝，等.正交試驗優化尼索地平口腔黏附片處方[J].中國藥房，2008，19（34）：2 682.

[6]Owen DH，Katz DF.A vaginal fluid simulant[J].Contraception，1999，59（2）：91.

[7]賈守雄，李 平，魏 琴，等.復方雌三醇陰道生物黏附膜的制備及體外釋放度考察[J].實用醫藥雜志，2007，2（30）：13.

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：附錄74.