TA方案對乳腺癌敏感率與DNA修復酶表達的相關性研究Δ

張曉麗 ，李海峰，李建鋒，劉開揚#，馬燕娜，杜，張鑫雨（.河北北方學院生命科學研究中心，河北張家口 07509；.河北北方學院法醫教研室，河北張家口 07509；.河北北方學院大學生科協，河北 張家口07509）

化學治療是乳腺癌綜合性治療的一部分，目前紫杉醇（Taxol，T）聯合阿霉素（Adriamy，A）方案在臨床有比較廣泛的應用，而療效高低報道不一致，臨床普遍認為癌細胞對藥物的敏感性與生物學特性有關。本試驗通過免疫組化染色及原代癌細胞培養技術，觀察并分析了83例乳腺癌中DNA修復酶O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）的表達與癌細胞對TA方案敏感率的關系。

表1 乳腺癌MGMT表達率及其他乳癌對TA方案的敏感率Tab 1 MGMT expression rate of breast carcinoma and susceptibility rate of breast cancer to TA scheme

表2 MGMT表達與TA方案敏感率的關系Tab 2 Relationship between MGMT expression and high sensitivity of TA scheme

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2004年9月－2006年7月河北北方學院第一附屬醫院乳腺癌切除標本83例，均為女性，年齡31～73歲，平均49.3歲。

1.2 儀器與試藥

5430型全自動二氧化碳（CO2）孵箱；DG-3022型酶標檢測儀（λ＝490 nm）；雙人超凈工作臺；96孔無菌培養板。

RPMI 1640培養液（美國GIBCOBRL公司）；小牛血清（上海伯奧生物科技公司）；二苯基溴化四氮唑鹽（美國SIGMA公司）；二甲基亞砜（DMSO）。抗癌藥物：TA方案（紫杉醇+阿霉素）。藥物使用的終濃度取臨床藥物血漿峰濃度的1/10（藥物濃度（μg·mL－1）＝60×D/5000÷50%×103。式中，D為臨床用藥劑量，單位為mg·kg－1；60為平均成人體重，單位為kg；50%為血細胞體積，單位為mL；乘以103后將mg換算為μg），計算得每毫升紫杉醇為960 μg，阿霉素為1.5 μg。免疫組化藥物：兔抗人MGMT多克隆抗體和SABC（（Strept avidin-biotin complex））試劑盒（武漢博士德生物技術公司）；DAB顯色劑（北京中杉金橋公司）。

1.3 方法

將乳腺癌組織標本置1640培養液送檢，2 h內開始試驗，分離癌細胞并計數，取含5×105個/100 μL的癌細胞懸液放入37℃、5%CO2培養箱培養4 h，加入化療藥物作用24 h后，每孔加入MTT 20 μL，4 h后棄上清液，每孔加DMSO 100 μL，10 min后檢測光密度（OD）值，波長選擇490 nm，并計算抑制率（IR）：

IR＝1－（加藥OD－不加藥OD）/不加藥OD×100%

免疫組化染色程序按試劑盒規程操作，微波進行抗原修復。陽性對照為已知陽性切片，陰性對照以PBS緩沖液代替Ⅰ抗。

1.4 判定標準

參考其他研究[1]，IR＞50%者為高敏感病例；IR為30%～50%者為敏感病例；IR＜30%者為不敏感病例；（高敏感病例+敏感病例）/總病例×100%＝總敏感率。MGMT陽性物為棕黃色，分布于細胞質。在一張切片上取10個低倍視野。其中，陽性細胞＞15%為陽性病例，＜15%為陰性病例。

1.5 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用四格聯列表法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

在乳腺癌中MGMT陽性（+）率為55.42%（46/83），TA方案敏感率為42.17%（35/83）。在不同病理類型中MGMT的表達組間比較無顯著性差異（P＞0.05），MGMT表達與淋巴結是否發生轉移有相關性，MGMT高表達與TA方案的敏感率呈低度相關（r＝0.23）。MGMT表達率及乳腺癌對TA方案敏感率和MGMT高表達與TA方案敏感率的關系詳見表1、表2。

3 討論

烷化劑是環境中普遍存在的一種致突變和致癌物質，其作用于DNA后，形成O6-烷基鳥嘌呤化合物。如果組織中MGMT異常，不能發揮正常作用或作用不足時，O6-甲基鳥嘌呤不能被及時移走，在DNA復制中，該化合物與胸腺嘧啶錯配，發生G：C→A：T突變（鳥嘌呤：胞嘧啶錯配為腺嘌呤：胸腺嘧啶），導致癌基因激活和抑癌基因失活，進一步導致腫瘤發生[2，3]。人類MGMT基因定位于10q26上，全長約170 kb，是一種普遍存在的DNA修復酶，可將烷化劑在鳥嘌呤O6位形成的加合物移除，使存在DNA損傷的細胞不再增殖，從而保持基因組的完整性[4]，所以MGMT表達陽性的患者對烷化劑類化療藥物敏感。提示MGMT的檢測對于臨床化療藥物的選擇具有指導意義。本試驗中MGMT的陽性率為55.42%（46/83），并有淋巴結轉移組MGMT的陽性表達率明顯高于無淋巴結轉移組（P＜0.01），但在不同病理類型組中，MGMT表達無顯著性差異（P＞0.05）。

烷化劑的藥理作用是通過釋放活潑的烷化基團，使DNA鳥嘌呤第6位氧原子烷基化，O6-AG不能與胞嘧啶配對，而與胸腺嘧啶共價結合，形成具有高度細胞毒性的DNA交鏈，影響DNA復制，導致細胞死亡。而MGMT可使6-RG的烷基基團轉移到自身的半胱氨酸殘基上，對烷化劑導致的DNA損傷具有修復作用，影響了烷化劑類化療藥物療效。在腫瘤治療方面，MGMT拮抗藥能明顯逆轉腫瘤對烷基類藥物的耐藥性，增加烷基類藥物療效。如何調控MGMT表達以達到最佳化療效果，是目前腫瘤治療中較感興趣的問題。MGMT基因多態性與腫瘤發生及治療、預后的關系也將是今后該領域研究另一重要方向。

紫杉醇是1963年從太平洋西岸的短葉紫杉樹中發現對許多腫瘤細胞有細胞毒性作用的天然物質。紫杉醇是一種新型抗微管藥物，其作用機制主要是促進微管蛋白的聚合，抑制微管的解聚，阻斷細胞周期M期和G期，從而阻止腫瘤細胞的增殖。近年來臨床研究[5～8]報道用紫杉醇單藥治療乳腺癌、肺癌、胃癌等，取得了良好成效。阿霉素為蒽環抗菌類化療藥物，對增殖細胞各期和G0期細胞都有作用，為細胞周期非特異性抗腫瘤藥物（CCNSA）。阿霉素抑制DNA合成的作用機制為：與DNA結合，作用于有絲分裂前期，從而抑制核酸合成和有絲分裂，誘導細胞死亡；自由基生成；與金屬離子結合；與細胞膜結合[9，10]。TA聯合方案，不僅使癌細胞分裂受阻，而停滯在G2期和M期，同時阿霉素阻斷（或抑制）DNA復制和RNA轉錄作用，導致細胞增殖停滯[11，12]，起到抗腫瘤作用。

本試驗顯示，乳腺癌患者對TA方案的總敏感率為42.17%（35/83），在46例MGMT陽性患者中，有24例對TA化療方案敏感，22例患者不敏感，通過四格聯列表法可知MGMT高表達與TA方案抑制率呈低度相關（r＝0.23），提示檢測MGMT在乳腺癌中的表達可以預測TA方案的敏感率。

本研究結果表明，乳腺癌細胞中MGMT的表達水平可以預測TA方案對乳腺癌的治療效果。因此，檢測乳腺癌中MGMT的表達狀況對于臨床化療方案的選擇有一定指導意義。

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