人參皂苷Rg1對局灶性腦缺血大鼠iNOS和eNOS表達的影響

鄒曉莉，杜繼衛，梁 佳，魏 嘉，包翠芬

(遼寧醫學院科學實驗中心，遼寧錦州121001)

缺血性腦病是指由于各種原因導致的腦血管堵塞，引起腦功能障礙的相應癥狀，嚴重危害人類健康。目前，該病的主要治療原則為擴張血管、恢復正常血液供應、縮小梗死面積、改善血管內皮細胞、抗動脈硬化等，而一氧化氮(NO)在維持腦血管張力和調節血壓方面起重要作用，其生成依賴于一氧化氮合酶(NOS)。2010年9月～2011年3月，本研究通過觀察大鼠局灶性腦缺血后腦組織誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、內皮細胞型一氧化氮合酶(eNOS)的表達變化及人參皂苷Rg1對它的作用，探討Rg1治療腦缺血損傷的機制，為防治缺血性腦病的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只，體質量250～300 g，本實驗室提供。藥品及試劑:人參皂苷Rg1，純度＞95%(吉林大學有機化學教研室提供);尼莫地平注射液(批號為071001，山西亞寶藥業);兔抗大鼠iNOS、eNOS單克隆抗體(SANTA CRUZ公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠局灶性腦缺血模型的制備及分組10%水合氯醛腹腔麻醉，采用改良線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型［1］。線栓采用直徑0.23 mm魚線，長度由頸外動脈分叉處計約18.5 mm，假手術組插入深度小于15 mm。栓塞時間2 h。動物清醒后參照Zea Longa的5分制評分標準，采用單盲法進行神經功能缺損程度判定。對不符合條件的大鼠予以剔除。對于實驗中剔除的大鼠均按嚴格的實驗條件統一補充、分組。將SD大鼠隨機分為6組各10只:假手術組、單純缺血組、人參皂苷 Rg1 10、20、40 mg·kg－1處理組(Rg1 低、中、高劑量組)、尼莫地平1 mg·kg－1陽性藥物處理組(control組)，每組10只。Rg1各組分別于術前5 d至取材前1 h腹腔注射人參皂苷Rg1，control組注射尼莫地平，其余各組分別注射等量生理鹽水，1次/d。

1.2.2 免疫組織化學法檢測iNOS、eNOS及圖像分析 缺血2 h后，各組大鼠10%水合氯醛麻醉，灌流固定，斷頭取腦，常規石蠟包埋。石蠟切片脫蠟至水，免疫組化二步法染色。iNOS和eNOS陽性表達為細胞質呈棕黃色。采用CIAS-1000圖像分析系統檢測每高倍視野iNOS、eNOS的陽性表達情況。

1.3 統計學方法 采用SPSS10.0軟件，數據均用ˉx±s表示，多組間差異顯著性檢驗采用單因素方差分析。P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

6組大鼠神經功能缺損評分及大腦皮層iNOS、eNOS表達陽性細胞數比較見表1。

3 討論

NO是一種新型生物信使分子，廣泛分布于生物體內各組織中，特別是神經組織中。NO是一種極不穩定的生物自由基，分子量小，可快速透過血腦屏障擴散;當血管壓力突然升高時，NO可維持腦血流量相對穩定，同時降低全身平均動脈血壓，控制全身各種血管床的靜息張力，增加局部腦血流量，是血壓及腦血管張力的主要調節因子。研究表明，腦短暫缺血后NO含量顯著升高，但缺血3 h后下降，提示NO在局灶性腦缺血過程早期起重要作用［2］。NO的生成主要依賴于NOS。NOS有三個亞型，即神經型(NOS1)、iNOS和eNOS。研究表明，正常情況下NOS的活性很低，但腦短暫缺血后iNOS表達顯著增多，eNOS無明顯改變。

表1 大鼠神經功能缺損評分及大腦皮層iNOS、eNOS陽性細胞數(ˉx ±s)

人參皂苷Rg1是人參的主要活性成分之一，具有抗氧化、清除自由基等腦保護作用，但是其作用機制還不甚清楚［3，4］。研究人員采用 Griess法、3HL精氨酸轉化法分別研究大鼠大腦皮層細胞NO含量及NOS活性，結果顯示Rg1可顯著減少老年鼠大腦皮層NO含量和降低NOS活性。提示Rg1的抗衰老作用與其對NOS活性的抑制有關［5］。研究人員還發現，采用多巴胺誘導的PC12細胞凋亡用以模擬阿爾茨海默病，細胞NO代謝產物水平顯著上升，預先應用不同濃度的人參皂苷Rg1進行處理，發現水平顯著下降，并且濃度不同則調節效果不同，以濃度高組對含量的調節效果更為明顯［6］;李瑋等檢測β淀粉樣蛋白1-40誘導THP-1細胞上清中NO濃度和iNOS表達情況，結果顯示Aβ模型組iNOS的表達明顯高于對照組，應用人參皂苷處理后THP-1細胞iNOS的表達和NO的產生明顯減少，隨著人參皂苷劑量的增大，THP-1細胞iNOS的表達和NO的產生明顯減少，且有劑量依賴性。提示人參皂苷可抑制THP-1細胞iNOS的表達，進一步影響 NO 的產生［7］。尚吉文等［8］采用全自動生化分析儀測定海綿體NO含量，結果發現去勢組陰莖海綿體NO濃度較對照組顯著降低，25 mg/kg人參皂苷組陰莖海綿體NO水平與去勢組接近，100 mg/kg人參皂苷組NO水平較去勢組明顯升高，與對照組接近。提示人參皂苷可以提高去勢大鼠陰莖海綿體組織NO水平，減少海綿體細胞凋亡，其對去勢大鼠陰莖海綿體細胞凋亡的抑制作用可能與其增加NO水平有關。

本實驗結果顯示，假手術組無神經功能缺損，而神經元胞質內有少量的iNOS、eNOS陽性表達細胞;單純缺血組大鼠則出現明顯的神經功能缺損癥狀，神經元胞質內iNOS表達顯著增多，而eNOS表達無明顯改變;與單純缺血組比較，人參皂苷Rg1處理組神經功能缺損癥狀得到顯著改善，神經元iNOS陽性細胞數量顯著減少，eNOS陽性細胞顯著增多，以高劑量組改變最為顯著，提示人參皂苷Rg1可能通過下調神經元iNOS、上調eNOS表達，調節NO水平，平衡腦血流量，維持血管張力，調節血壓，從而減輕缺氧所致的腦損傷，發揮腦保護作用，但是iNOS、eNOS在改善腦缺血方面如何發揮作用還有待深入研究。

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