阿托伐他汀對心肌梗死后大鼠主動脈平滑肌NADPH氧化酶的影響

高艷周，王小燕，李紅霞，韓蓮花，李 勛

(蘇州大學附屬第一醫院，江蘇蘇州215006)

體內活性氧產生超過內源性抗氧化防御系統的清除能力時便發生氧化應激，研究表明氧化應激在動脈粥樣硬化等血管性疾病的發生發展過程中起重要作用。近來發現NADPH氧化酶是心血管系統產生活性氧的主要來源［1］。他汀類藥物除調脂作用外，尚具抗氧化作用，但其作用機制尚不十分清楚。2010年6月～2011年5月，本研究通過建立大鼠心肌梗死(心梗)模型，并予阿托伐他汀進行干預，測定主動脈平滑肌超氧陰離子()濃度及Nox1 mRNA和Nox4 mRNA表達，旨在探討心梗后平滑肌NADPH氧化酶的變化及阿托伐他汀對其干預作用。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由蘇州大學動物實驗中心提供，測定試劑盒購自江蘇碧云天生物試劑公司，RT-PCR試劑盒購自美國Fer-mentas公司，引物購自上海生工技術服務有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 取體質量230～260 g雄性SD大鼠，用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)行腹腔麻醉，開胸暴露心臟結扎左前降支為手術組，僅穿線而不結扎為假手術組，手術組大鼠于術后第二天隨機給予10 mg/(kg·d)阿托伐他汀或等體積生理鹽水灌胃5周，設為心梗干預組和心梗組。術后第6周共存活大鼠20只，其中假手術組6只，心梗組8只，心梗干預組6只;用10%水合氯醛麻醉并開胸取胸主動脈平滑肌。

1.2.3 Nox1 mRNA和Nox4 mRNA表達水平測定采用RT-PCR法。取大鼠主動脈平滑肌組織按Trizol試劑盒說明用三氯甲烷—異丙醇—乙醇一步法提取總RNA，260 nm紫外分光光度計定量。取2 μg總RNA按MMLV試劑盒逆轉錄說明書進行逆轉錄，cDNA作為PCR反應模板。Nox1引物序列為sense:5'-ATAGCTACTGCCCACCCCAAGT-3'，antisense:5'-TTGAGTACCGCCGACAGCA-3'(99 bp);Nox4引物序列為sense:5'-GAACCTCAACTGCAGCCTGATC-3'，antisense:5'-CTTTGTCAACAATCTTCTTGTTCTC-3'(111 bp);β-actin引物序列為 sense:5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'(241 bp)。antisense:5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'。取5μL反應產物于1%瓊脂糖凝膠電泳后經凝膠成像系統分析處理，以目的基因表達量與β-actin表達量比值作為Nox1和Nox4 mRNA的相對表達量。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件，計量資料以xˉ±s表示，不同組間均數比較采用方差分析，兩變量相關性采用線性相關分析。P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.2 各組平滑肌Nox1 mRNA及Nox4 mRNA表達的比較 心梗組Nox1 mRNA表達(0.68±0.05)顯著高于假手術組(0.44±0.06)(P ＜0.01)和心梗干預組(0.46 ±0.05)(P ＜0.05)，心梗干預組與假手術組間比較無統計學差異(P＞0.05)。心梗組Nox4 mRNA表達(0.67±0.06)顯著高于假手術組(0.46±0.08)(P ＜0.01)和心梗干預組(0.48 ±0.07)(P＜0.05)，心梗干預組與假手術組間比較無統計學差異(P＞0.05)。見圖1。

圖1 Nox1 mRNA和Nox4 mRNA表達的電泳圖

3 討論

隨著生活節奏的加快及飲食結構的改變，急性心梗的發病率逐年上升，且呈現明顯的年輕化趨勢，而再灌注治療的廣泛開展使急性心梗患者的救治成功率明顯提高，但心梗后由于心肌細胞喪失、血流動力學發生異常而使神經體液因素激活，機體發生氧化應激，最終導致心力衰竭的發生;此外，機體氧化應激也可以導致血管功能和結構改變，使血流動力學進一步惡化。故盡可能減少心肌壞死以保持心臟功能及應用藥物抑制神經體液因素激活和氧化應激的發生成為當今急性心梗的主要治療措施。

NADPH氧化酶包括Nox1-5和Duox1-2，統稱為Nox家族，血管平滑肌則主要表達 Noxl和 Nox4［2］，稱為血管細胞NADPH氧化酶。黃湘等［3］發現心梗患者血清蛋白氧化產物、丙二醛、超氧化物歧化酶和氧化型低密度脂蛋白水平較健康組明顯升高，說明心梗后存在氧化應激。活性氧產生增多可誘導血管內皮細胞凋亡［4］、使NO滅活增加而致血管舒張功能下降、促進平滑肌細胞增殖［5］而致血管重構，最終導致外周血管阻力增加。本研究發現，心梗組O－濃度顯著高于假手術組，進一步的研究發現

2 Nox1 mRNA和Nox4 mRNA表達增加，且表達水平與濃度升高相關，提示心梗后平滑肌Nox1 mRNA及Nox4 mRNA表達增加導致生成增加。Wingler等［6］研究發現，培養的大鼠主動脈平滑肌暴露于血管緊張素Ⅱ的時間愈長，Nox1 mRNA及Nox4 mRNA表達愈高。

他汀類藥物具有藥物多效性。本研究發現阿托伐他汀可通過抑制Nox1 mRNA及Nox4 mRNA表達而減少產生。Maack等［7］對心衰患者的研究發現阿托伐他汀可減少生成，表明阿托伐他汀可抑制氧化應激。另有研究提示，阿托伐他汀通過降低NADPH氧化酶的表達和活性［8，9］而減少生成。

［1］Babior BM，Lambeth JD，Nauseef W.The neutrophil NADPH oxidase［J］.Arch Biochem Biophys，2002，397(2):342-344.

［2］Tamara M，Paravicini，Lerna M，et al.Increased NADPH oxidase activity，gp91phox expression，and endothelium-dependent vasorelaxation during neointima formation［J］.Circ Res，2002，91(1):54-61.

［3］黃湘，譚家余，楊彩，等.老年急性心肌梗死與氧化應激的關系研究［J］.西北國防醫學雜志，2009，30(5):334-336.

［4］ Pollman MJ，Hall JL，Gibbons GH.Determinants of vascular smooth muscle cell apoptosis after balloon angioplasty injury.Influence of redox state and cell phenotype［J］.Circ Res，1999，84(1):113-121.

［5］Alvarez A，Sanz MJ.Reactive oxygen species mediate angiotensinⅡ-induced leukocyte-endothelial cell interactions in vivo［J］.Leukoc Biol，2001，70(2):199-206.

［6］Wingler K，Wunsch S，Kreutz R，et al.Upregulation of the vascular NAD(P)H-oxidase isoforms Nox1 and Nox4 by the renin-angiotensin system in vitro and in vivo［J］.Free Radic Biol Med，2001，31(11):1456-1464.

［7］Maack C，Kartes T，Kilter H，et al.Oxygen free radical release in human failing myocardium is associated with increased activity of rac1-GTPase and represents a target for statin treatment［J］.Circulation，2003，108(13):1567-1574.

［8］Wang CY，Liu PY，Liao JK.Pleiotropic effects of statin therapy:molecular mechanisms and clinical results［J］.Trends Mol Med，2008，14(1):37-44.

［9］Cangemi R，Loffredo L，Carnevale R，et al.Early decrease of oxidative stress by atorvastatin in hypercholesterolaemic patients:effect on circulating vitamin E［J］.European Heart Journal，2008，29(1):54-62.