己酮可可堿對(duì)人食管癌細(xì)胞EC9706的5-Fu化療增敏作用

宋慧琴，李道明

(1河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南開封475000;2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

己酮可可堿(PTX)為磷酸二酯酶抑制劑，能增加細(xì)胞內(nèi)cAMP，并有改善血流動(dòng)力學(xué)、免疫抑制和抗纖維化的作用。其可以抑制IκBα的磷酸化及降解，抑制NF-κB的活性。PTX在腫瘤治療中的作用已引起人們的廣泛關(guān)注，如PTX可去除化療藥物引起的細(xì)胞周期阻滯，增強(qiáng)順鉑、苯丙氨酸氮芥和柔紅霉素等化療藥物的細(xì)胞毒性，激活凋亡信號(hào)途徑，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡［1］。5-氟尿嘧啶(5-Fu)作為胸苷酸合成酶抑制劑，是被廣泛應(yīng)用的化療藥物，當(dāng)5-Fu進(jìn)入體內(nèi)，即轉(zhuǎn)變?yōu)?-氟尿嘧啶脫氧核苷酸，抑制脫氧胸苷酸合成酶，影響DNA合成［2］。2007年6月～2008年6月，本研究探討了5-Fu和PTX聯(lián)合5-Fu對(duì)EC9706細(xì)胞的抑制作用，為尋找治療食管癌的新方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌細(xì)胞株EC9706由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。PTX由河南康諾醫(yī)藥公司惠贈(zèng)，5-Fu購(gòu)自上海旭東海普藥業(yè)公司，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 對(duì)照組，不加藥物，作為各處理組各劑量水平的共同對(duì)照;PTX處理組，設(shè)置0.01 mg/mL、0.10 mg/mL、0.50 mg/mL、1.00 mg/mL 4 個(gè)劑量水平;5-Fu處理組，設(shè)置25μg/mL、50μg/mL 2個(gè)劑量水平;PTX聯(lián)合5-Fu處理組，設(shè)置8個(gè)劑量水平。見表1。

表1 PTX聯(lián)合5-Fu用藥濃度分組

1.2.2 MTT方法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況 將1×105/mL EC9706細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，200 μL/孔，置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24 h后按分組加藥，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h，每孔加入 20 μL/孔 MTT(5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去每孔液體，加入 DMSO 150μL/孔，振蕩溶解15 min，以空白對(duì)照調(diào)零，用自動(dòng)酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)出各實(shí)驗(yàn)組的OD值。求平均值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組OD值－實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以ˉx±s表示。將所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn)。P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 5-Fu、PTX聯(lián)合5-Fu作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 倒置顯微鏡下觀察，對(duì)照組的細(xì)胞均呈上皮性貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞輪廓清楚，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密，生長(zhǎng)旺盛，隨時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞層次增多。與對(duì)照組相比，5-Fu處理組細(xì)胞24 h出現(xiàn)部分細(xì)胞皺縮，漂浮，胞質(zhì)渾濁，并隨時(shí)間延長(zhǎng)和藥物濃度增高，數(shù)量減少，出現(xiàn)細(xì)胞碎片。見圖1～4。與對(duì)照組相比，PTX聯(lián)合5-Fu處理組細(xì)胞12 h即出現(xiàn)部分細(xì)胞皺縮，漂浮，胞質(zhì)渾濁，并隨時(shí)間延長(zhǎng)和藥物濃度增高，細(xì)胞數(shù)量更少，出現(xiàn)大量漂浮細(xì)胞和細(xì)胞碎片。見圖5～8。

圖1 ～4 25μg/mL 5-Fu組細(xì)胞12～72 h生長(zhǎng)情況(400×)

圖5 ～8 0.5 mg/mL PTX聯(lián)合5-Fu組細(xì)胞12～72 h生長(zhǎng)情況 (400×)

2.2 5-Fu、PTX聯(lián)合5-Fu對(duì)EC9706細(xì)胞的增殖抑制結(jié)果 見表2、3。

3 討論

表2 不同時(shí)間25μg/mL 5-Fu、PTX聯(lián)合5-Fu對(duì)EC9706細(xì)胞的增殖抑制作用(ˉx±s)

表3 不同時(shí)間50μg/mL 5-Fu、PTX聯(lián)合5-Fu對(duì)EC9706細(xì)胞的增殖抑制作用(ˉx±s)

食管癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，其中河南省尤為高發(fā)。在我國(guó)食管癌病死率居惡性腫瘤的第四位［3］，嚴(yán)重威脅著人們的健康和生命。5-Fu是食管癌的常規(guī)化療藥物，然而，食管癌對(duì)化療藥物的敏感性較低。化療耐藥是化療藥物療效偏低的主要原因，是當(dāng)今腫瘤治療的一大難題，也是綜合治療失敗的一個(gè)重要原因。

PTX作為一種非選擇性磷酸二酯酶抑制劑，可抑制IκBα的磷酸化及其降解，從而抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的 NF-κB 的活性［4］。Futakuchi等［5］研究發(fā)現(xiàn)，PTX可明顯抑制荷瘤小鼠肝細(xì)胞癌的NF-κB的活性，減少肺轉(zhuǎn)移幾率。近年研究表明，NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性被大多數(shù)前凋亡信號(hào)包括TNF-α、抗腫瘤藥物、電離輻射所激活，從而誘導(dǎo)凋亡抑制基因表達(dá)，對(duì)抗化療藥物引起的細(xì)胞凋亡，這是誘導(dǎo)腫瘤化療耐藥性的主要機(jī)制。抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［6］，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療、放療的敏感性。

有研究發(fā)現(xiàn)，PTX可以增強(qiáng)(E)-(2’)-脫氧—氟亞甲基胞苷對(duì)結(jié)腸癌和宮頸癌的細(xì)胞毒性和對(duì)放射的增敏作用［7，8］，然而，關(guān)于 PTX 增加化療藥敏感性的機(jī)制目前還不是很清楚，有學(xué)者認(rèn)為PTX可以去除化療藥物引起的S期阻滯，使細(xì)胞攜帶未修復(fù)的DNA損傷進(jìn)入下一周期，激活凋亡信號(hào)途徑，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡［7］。Eley等［9］發(fā)現(xiàn)，PTX 增強(qiáng) p53突變或缺失腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。Honess等［10］發(fā)現(xiàn)，PTX可增加腫瘤的血液灌注，提高腫瘤細(xì)胞的供氧、從而增強(qiáng)了細(xì)胞的化療敏感性。而PTX對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的作用國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。

本研究中細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，5-Fu、PTX聯(lián)合5-Fu作用于EC9706細(xì)胞12～72 h，在同一時(shí)間段，隨著5-Fu和PTX藥物濃度的增加，對(duì)EC9706細(xì)胞的抑制作用也增強(qiáng)，而PTX聯(lián)合5-Fu組與單用5-Fu組相比，對(duì)EC9706細(xì)胞的抑制作用出現(xiàn)得早，強(qiáng)度大。說明PTX可以增加5-Fu對(duì)EC9706細(xì)胞的抑制作用。MTT結(jié)果顯示，5-Fu、PTX聯(lián)合5-Fu作用于 EC9706 12～72 h，在同一時(shí)間段，隨著PTX藥物濃度的增加，5-Fu對(duì)EC9706細(xì)胞的抑制作用也增強(qiáng)，聯(lián)合組Ⅲ、Ⅳ(PTX 0.5 mg/mL、1.0 mg/mL與5-Fu 25μg/mL聯(lián)合組)與50μg/mL 5-Fu組EC9706細(xì)胞抑制率相近。PTX尤其是在中高濃度對(duì)25μg/mL 5-Fu的化療增敏作用明顯，而PTX對(duì)50μg/mL 5-Fu增敏作用較差。說明PTX可以增加EC9706細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性，減少5-Fu的劑量。

目前，PTX已經(jīng)廣泛應(yīng)用于慢性周圍血管和靜脈循環(huán)障礙引起的疾病，安全性能好。本研究結(jié)果提示，PTX可以使5-Fu對(duì)EC9706細(xì)胞的抑制作用提前出現(xiàn)，并使EC9706細(xì)胞對(duì)5-Fu更具有敏感性，從而可以減少5-Fu的劑量。如果將PTX應(yīng)用于食管癌的化療可能具有非常實(shí)際的意義。

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