姜黃素對潰瘍性結腸炎大鼠的抗炎作用及其對腸黏膜IL-23的影響

廖 輝，曾昭靜，呂小平，詹靈凌，陳 蘭

(1廣西醫科大學第一附屬醫院西院，廣西南寧530021;2廣西醫科大學第一附屬醫院臨床醫學實驗部)

炎癥性腸病(IBD)是一組慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要表現為長期反復發作的腹痛、腹瀉、黏液膿血便，具有慢性和消耗性的特征，包括潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。該病在歐美國家發病率比較高，近年我國的發病率及患病率也在上升。至今IBD的病因和發病機制尚未完全明確，目前公認，免疫調節異常在IBD發生發展中起重要作用。已有研究表明，IL-23/IL-17軸在IBD的發病機制中可能處于關鍵地位［1，2］，并有望成為 IBD 新的治療靶標。現階段，IBD的治療手段非常有限，藥物治療主要以5-氨基水楊酸制劑、糖皮質激素、免疫抑制劑和生物制劑為主，但都存在不同的局限性和毒副作用。姜黃素是從姜科植物中提取的一種相對分子質量小的多酚類物質，具有一定的免疫調節、炎癥抑制功能。2010年6月～2011年5月，本研究應用姜黃素干預實驗性大鼠結腸炎模型，探討其對IL-23表達的影響及對實驗性大鼠結腸炎的治療作用，進一步研究IBD的病因和發病機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物:健康成年雄性SD大鼠80只，體質量180～220 g，購自廣西醫科大學實驗動物中心。主要試劑:姜黃素購自BBI公司、三硝基苯磺酸(TNBS)購自sigma公司、柳氮磺吡啶(SASP)購自上海三維藥業有限公司、抗體購自santa cruz公司，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及模型建立 將80只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、姜黃素組、SASP組，每組均為20只。模型組、姜黃素組、SASP組大鼠分別以100 mg/kg TNBS乙醇溶液灌腸制備大鼠結腸炎模型，TNBS模型參照Morris等方法制作:大鼠禁食24 h，水合氯醛麻醉后由肛門插入硅膠管至腸道內約8 cm，一次性結腸灌注100 mg/kg TNBS(溶于50%乙醇溶液，總體積為1 mL)，提起尾部倒立3 min后，放回籠內常規飼養。正常對照組予相同劑量的0.9%氯化鈉溶液灌腸;正常對照組、模型組每日予相同劑量的0.9%氯化鈉溶液灌胃;姜黃素組自造模第2天起每日予100 mg/kg姜黃素溶液灌胃;SASP組大鼠也于造模第2天每日予100 mg/kg的SASP溶液灌胃。造模第8天處死大鼠，采集大鼠結腸標本備檢。

1.2.2 癥狀、體征觀察及評分 造模后觀察各組大鼠體質量變化、大便性狀、便血情況，參照Okayasu等［3］的經典評分系統方法，每日將體質量下降、大便性狀和隱血或便血情況的評分相加，作為疾病活動指數(DAI)(DAI=體質量減輕率分數+大便性狀分數+隱血程度分數/3)。

1.2.3 標本采集及結腸黏膜組織學損傷評分 光鏡觀察結腸黏膜組織病理學變化，并進行炎癥損傷評分:造模第8天處死大鼠，距肛門2、6、10 cm處取3段長約1 cm的大鼠結腸組織，制備石蠟切片，行蘇木精—伊紅(HE)染色，以盲法觀察，在光學顯微鏡下觀察腸黏膜損傷情況，參照 Butzner等［4，5］CMDI、Dieleman評分標準進行評分。

1.2.4 腸黏膜組織IL-23 mRNA水平的測定 采用RT-PCR法。按Trizol法提取各組大鼠結腸組織總RNA，使用分光光度計檢測總RNA的濃度之后，進行逆轉錄反應合成cDNA，并取逆轉錄產物cDNA用于PCR擴增，取PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統成像，目標mRNA的表達量使用內參照β-actin進行校正。紫外燈下以凝膠圖像掃描儀測A值，用GAPDH校正半定量，計算目的基因相對表達水平。RT-PCR引物序列:IL-23 p19:上游引物:5'-CTGACAGACTCTGCTTCCTCGCTAC-3';下游引物:5'-CGAACAGCCCGAGATAGGACAAG-3'(355 bp);β-actin:上游引物:5'-CCCATACCCAC CATCACACC-3';下游引物:5'-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'(207 bp)。RT-PCR反應條件:PCR Mix 12.5 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模版1.5 μL，加DEPC-treated water至25μl。反應條件為:95℃，5 min;94 ℃，30 s;55 ℃，30 s;72 ℃，45 s，共 35個循環;最后72℃，7 min。

1.2.5 腸黏膜組織IL-23蛋白表達水平的測定

采用Western blot提取各組大鼠腸黏膜組織中的總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒在570 nm波長處測定總蛋白濃度。蛋白經過10%SDS-PAGE電泳后，將凝膠中蛋白電轉移至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶粉TBS液封閉后，加入一抗搖床孵育過夜，洗滌后加入二抗，室溫孵育80 min后，ECL底物化學發光顯色后曝光顯影。目標條帶使用圖像分析軟件進行分析，目標蛋白表達量使用β-actin進行校正。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗;計量資料以ˉx±s表示，多組間比較采用完全隨機設計方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差法(LSD)檢驗;兩變量間相關關系的分析采用直線相關分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況、結腸組織大體形態及組織學評分 見表1、圖1。

2.2 各組結腸組織IL-23的表達 見表2、圖2、圖3。

表1 各組DAI及腸黏膜組織損傷評分(分，ˉx±s)

圖1 結腸組織鏡下觀察(HE×200)

表2 各組大鼠結腸組織IL-23 mRNA和蛋白的表達(ˉx±s)

圖2 各組結腸組織IL-23 mRNA表達

圖3 各組結腸組織IL-23蛋白表達

3 討論

IBD是一組病因未明的非特異慢性腸道炎癥性疾病，現已成為消化系統常見病及慢性腹瀉的主要病因。其發病機制尚不完全明確，有研究顯示，腸壁黏膜免疫調節異常、持續腸道感染、腸壁黏膜屏障缺損、遺傳和環境等因素共同參與該疾病的發生發展［6，7］，其中先天性免疫和適應性免疫調節異常在IBD的發生、發展過程中發揮著重要作用［8］。

IL-23是IL-12分子家族中的促炎性細胞因子，主要是由激活的單核—巨噬細胞和樹突狀細胞分泌，由IL-12p40和IL-23p19亞單位組成。IL-23具有十分復雜的生物學功能，參與機體控制感染和自身免疫性疾病發生［9～11］。其主要介導 Th17細胞群的擴增并維持其存活，Th17細胞主要介導機體的炎性反應(防御胞外病原菌的感染)、自身免疫反應、IBD、腫瘤和移植排斥等的發生和發展，具有高致病性［10］。研究表明，IL-23在某些自身免疫性疾病中的表達增高，如實驗性過敏性腦脊髓炎、膠原誘導性關節炎及人類銀屑病等［12］。近年國外研究證實，IL-23 在 IBD 的發生中起重要作用［10，13］，其可通過誘導并驅動Th17細胞產生IL-17、IL-6和TNF-α等，引起炎癥細胞因子級聯反應，形成結腸炎癥。劉占舉等［14］發現 IL-23在 IBD中表達增高，并能誘導IBD患者淋巴細胞效應應答，促使腸黏膜炎性反應，尤其是CD患者腸黏膜炎性肉芽腫形成，導致黏膜組織損傷、腸壁黏膜增厚。

已有研究表明，IL-23/IL-17軸在IBD的發病機制中可能處于關鍵地位［1，2］。另有動物實驗表明，敲除IL-23和IL-12共有的p40基因或用單克隆抗體中和治療處理后TNBS未能誘發出小鼠結腸炎［2］。Kullberg 等［15］在小鼠結腸炎模型中，通過將幼稚的T淋巴細胞轉移至免疫缺陷型、RAG基因敲除小鼠中，引起宿主腸道感染，發現結腸炎在p19和p40缺陷型小鼠中可被抑制，而在IL-12特異性亞基p35缺陷型小鼠中不能被抑制，結腸炎的抑制程度與炎性因子TNF、IL-6、IFN-γ的減少有相關性。可見，IL-23通過激活潛在的 T細胞介導的免疫反應在腸道感染的發生、發展中起重要作用。有關人體IBD的研究發現，IL-23p19 mRNA在 CD患者的轉錄水平明顯升高，在UC患者輕度升高，在特異性腸炎和正常人中沒有升高［16］。Fuss等［17］也發現 CD患者中IL-23水平升高，并且用 IL-12p40 mAb治療后IL-23的水平下降。以上結果均提示IL-23在IBD的發病機制中可能起關鍵作用。

本實驗采用Western blot法檢測大鼠結腸組織的IL-23p19蛋白水平，RT-PCR法測大鼠結腸組織IL-23 mRNA的表達，發現模型組大鼠的IL-23 mRNA和蛋白表達水平與正常對照組相比均顯著升高，且與疾病活動指數呈正相關，與Yen等［18］研究結果一致，提示IL-23在大鼠結腸炎的發生中發揮著重要作用，并與疾病嚴重程度相關。

國內外多項研究表明，姜黃素可調控IBD大鼠模型中的炎癥因子表達，簡燕婷等［19］用姜黃素干預IBD大鼠模型發現能使腸黏膜細胞致炎因子IL-1β mRNA的表達受抑制，而抗炎因子IL-10 mRNA的表達增強;夏劍等［20］報道實驗性結腸炎中，姜黃素通過抑制NF-κB、TNF-α表達而達到抗炎效果;張明等［21］研究發現姜黃素抗炎作用與抑制IL-12調節Thl/Th2細胞因子平衡有關。

本研究發現，模型組大鼠精神差、毛色粗糙、排血便或無排便，體質量明顯下降，至造模結束仍低于造模前水平，炎性指標IL-23 mRNA及蛋白表達顯著增高;姜黃素組大鼠經姜黃素治療后上述改變均得到明顯改善，體質量逐漸恢復或超越造模前水平，大鼠的DAI、大體形態和組織學損傷情況均明顯降低，IL-23 mRNA及蛋白表達下降。說明姜黃素能夠降低IL-23的蛋白及mRNA表達水平，對實驗性大鼠結腸炎有明顯的抑制作用，其是治療IBD大鼠模型的有效藥物。

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