肺癌組織中14-3-3ζ的表達與上皮細胞間質轉化的相關性研究

王琳琳，于洪升，蔣捍東，2

(1青島大學醫學院附屬醫院，山東青島266003;2上海交通大學附屬仁濟醫院)

近年研究發現，上皮細胞間質轉化(EMT)在各種上皮細胞來源的惡性腫瘤侵襲轉移過程中發揮了重要作用［1］，是惡性腫瘤轉移的早期事件。所以EMT相關因子的研究逐步成為熱點，并有望為腫瘤靶向治療提供新的依據。14-3-3蛋白是一個廣泛表達的酸性蛋白家族，最初在腦脊液提取物中被發現，14-3-3蛋白的亞型與腫瘤的發生密切相關，并被作為潛在的腫瘤抑制基因或致瘤基因，近年來14-3-3ζ與肺癌的研究逐漸增多，但與EMT和腫瘤轉移的關系研究很少，本研究采用免疫組化法檢測14-3-3ζ與上皮性鈣黏附素(E-cad)、波形蛋白(vimentin)在肺癌組織中的表達，并分析14-3-3ζ與E-cad、vimentin的相關性及其臨床病理特征，以期揭示14-3-3ζ在EMT和腫瘤轉移中的作用及其臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料 收集青島大學醫學院附屬醫院2008～2011年手術切除的60例肺癌患者石蠟包埋組織(患者術前均未經過化療和放療)，其中鱗癌34例，腺癌26例;高分化16例，中分化23例，低分化21例;淋巴結轉移36例，無淋巴結轉移24例。以35例肺癌患者癌旁正常肺組織作對照。鼠抗人E-cad和vimentin單克隆抗體及DAB顯色試劑盒由北京中杉金橋生物有限公司提供。鼠抗人14-3-3ζ和craf單克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 免疫組織化學染色:切片、組織切片進行預處理、阻斷內源性過氧化物酶、抗原修復、滴加一抗、滴加通用型IGG抗體-HRP多聚體、應用DAB溶液顯色。蘇木靜復染，常規脫水，透明，封片。結果判定:免疫組化染色以胞膜、胞質和胞核內出現棕黃色顆粒為陽性，按照染色強度與陽性細胞百分比的乘積評分:即0～2分(－)，3～4分(+)，5～7分(++)，8～9分(+++)。參考 Sarrio等［2］方法，選擇E-cad表達陰性同時vimentin表達陽性的病例，記為EMT(+)。

1.2.2 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件，組間表達差異的分析采用χ2檢驗，各因子表達的相關性采用Pearson相關分析。P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 E-cad、vimentin 在肺癌的表達 E-cad 陽性表達于細胞膜和(或)胞質上，vimentin表達在胞質上。見圖1、2。肺癌中E-cad和vimentin的陽性表達率分別是 31.70%(19/60)、51.70%(31/60)，正常肺組織分別是77.10%(27/35)、0(0/35)。肺癌組織與正常肺組織的E-cad及vimentin陽性表達比較有統計學差異(χ2值分別為 18.30、26.84，P 均 ＜0.01)。

圖1 E-cad在肺癌組織中的表達(HE，×200)

圖2 vimentin在肺癌組織的表達(HE，×200)

2.2 14-3-3ζ、c-raf在肺癌組織中的表達 肺癌組織中14-3-3ζ陽性表達在細胞質和膜上，c-raf陽性表達在細胞質中，鏡下呈棕黃色顆粒。見圖3、4。14-3-3ζ、c-raf在肺癌組織中的陽性表達率分別是45.00%(27/60)、30.00%(18/60)，在正常肺組織分別為5.71%(2/35)、2.85%(1/35)，肺癌組織中的14-3-3ζ、c-raf陽性表達明顯高于正常肺組織(χ2值分別為16.09、10.18，P 均 ＜0.01)。

圖3 14-3-3ζ在肺癌組織中的表達(HE，×200)

圖4 c-raf在肺癌組織中的表達(HE，×200)

2.3 肺癌組織中 14-3-3ζ、c-raf、E-cad、vimentin 的表達與臨床病理特征的關系 見表1。

表1 肺癌組織中14-3-3ζ、c-raf、E-cad、vimentin的表達與臨床病理特征的關系(例)

2.4 肺癌組織中14-3-3ζ、c-raf的表達與EMT的相關性 EMT(+)組肺癌組織中14-3-3ζ、c-raf的陽性表達率分別是 79.20%(19/24)、54.20%(13/24)，EMT(－)組肺癌組織中14-3-3ζ、c-raf的陽性表達率分別是 22.20%(8/36)、13.90%(5/36)，即 14-3-3ζ、c-raf在EMT(+)組的陽性表達率明顯高于EMT( －)組(χ2值分別為 18.87、11.12，r值分別為0.925、0.820，P 均 ＜0.01)。

2.5 肺癌組織中14-3-3ζ的表達與c-raf的相關性c-raf(+)組中14-3-3ζ的陽性表達率是72.20%(13/18)，c-raf(－)組肺癌組織中14-3-3ζ的陽性表達率是 33.30%(14/42)，即 c-raf(+)組 14-3-3ζ的陽性表達明顯高于 c-raf(－)組(χ2=7.699，r=0.705，P ＜0.01)。提示14-3-3ζ與c-raf在肺癌組織中的異常表達存在相關性。

3 討論

14-3-3蛋白是一個廣泛表達的酸性蛋白家族，它的亞型與腫瘤的發生密切相關，并被作為潛在的腫瘤抑制基因或致瘤基因［3，4］，因此，14-3-3 蛋白的不同亞型可以為抗癌治療提供新的途徑。14-3-3ζ是該家族中的一個亞型，有關14-3-3ζ與肺癌的關系已逐漸成為研究熱點。Qi等［5］利用RT-PCR和Western blot檢測到正常肺組織中14-3-3ζ的微量存在，而肺癌組織中表達增高。臧東鈺等［6］研究發現，14-3-3ζ在正常肺組織中微量表達，在NSCLC中表達顯著增多，且隨著肺癌分化程度的降低，其陽性表達率逐漸增強。本實驗發現，14-3-3ζ在正常肺組織中陽性表達率低于肺癌組織，同時高中分化組陽性表達率低于低分化組，提示14-3-3ζ的表達與肺癌的分化程度存在相關性，可能促進了肺癌的發生和發展。本研究中淋巴結轉移陽性組14-3-3ζ的表達率高于淋巴結轉移陰性組，與臧東鈺等［6］結果一致，由此認為14-3-3ζ在癌細胞的侵襲和淋巴結轉移中也發揮了至關重要作用。

EMT的特征主要是失去上皮細胞特性，表達間質細胞特點［7］，表現為E-cad蛋白的下降，vimentin表達的增加，導致細胞運動力增強，增加腫瘤的侵襲性和轉移性。EMT存在于人體多個生理和病理過程中，它的發生涉及到多個信號轉導通路和復雜的分子機制，其中一條重要的通路是受體酪氨酸激酶ras/MAPK通路，絲氨酸/蘇氨酸酶 c-raf信號作為ras的效應物，反作用于TGF-β的生長抑制和誘導凋亡，強化TGF-β的致侵襲效應，從而誘導MDCK細胞(Madin-Darby canine kidney，一種英國小獵犬的腎細胞)發生EMT。Huang等［8］在對前列腺癌的研究中發現此信號通路可通過TGF-β的介導，增強MMP-2的分泌，最終導致腫瘤細胞的侵襲。Janda等［9］的研究結果表明，c-raf可以減少E-cad的表達，降低細胞間黏附作用，促進EMT的發生。本研究也發現，EMT(+)組肺癌組織中c-raf的陽性表達高于EMT(－)組，我們推測c-raf作為ras的效應物在ras/MAPK通路調控EMT的過程中起著重要作用，促進了EMT的發生。

有研究表明，ras作為c-raf的活性刺激因子不能充分活化c-raf，需要14-3-3ζ等參與，14-3-3ζ作用下的c-raf在無活性與有活性形式間快速轉變，14-3-3ζ蛋白的結合有助于靶蛋白活性調控信號的輸入，并在維持c-raf高度催化活性中發揮重要作用，14-3-3ζ可能是c-raf和ras復合物形成的協同分子［10］。Petosa等［11］研究發現，14-3-3ζ蛋白通過與 c-raf結合調節受體酪氨酸激酶ras/MAPK信號通路，促進腫瘤轉移。Matta等［12］研究發現，14-3-3ζ和EMT 標記蛋白β-catenin之間具有相關性，β-catenin可能是14-3-3ζ作用的一個靶點。本實驗顯示，14-3-3ζ的表達與c-raf存在相關性;14-3-3ζ在EMT(+)組的陽性表達率明顯高于EMT(－)組，我們推測14-3-3ζ在EMT過程中發揮著重要作用，促進了EMT的發生，進而促進腫瘤的轉移，受體酪氨酸激酶ras/MAPK信號通路可能是其調控EMT的一條途徑，在此通路中c-raf可能是14-3-3ζ的一個作用靶點，所以14-3-3ζ的深入研究將有望為肺癌的診斷和治療開辟一條新的途徑。

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