龍血素B對肝星狀細胞增殖及細胞外基質分泌的影響

李玉蓮，范 紅，宋正己，彭 偉，陳艷敏，高建梅(昆明醫學院附屬昆華醫院，云南昆明650032)

肝星狀細胞(HSC)在肝臟受到炎癥或機械刺激時被激活，其激活是肝纖維化和最終肝硬化發生的中心事件［1］;抑制 HSC激活、增生，或促進激活的HSC凋亡是治療肝纖維化的重要途徑。2010年9～2011年6月，本實驗應用HSC-T6細胞系，觀察龍血素B對HSC增殖及細胞外基質分泌的影響，以探索臨床抗肝纖維化的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗細胞與藥物:HSC-T6細胞系，購于中國科學院昆明細胞庫;龍血素B中藥化學對照品，購于中國藥品生物制品檢定所(用甲醇配成10 μg/μL的原液，臨用時加入含 10%小牛血清的DMEM高糖培養液，并稀釋為所需濃度)。主要試劑及儀器:DMEM高糖培養液、PBS緩沖液均購自北京海克隆;新西蘭新生牛血清購于美國Gibco公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)購于sigma公司;青霉素—鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶溶液均購自Bioind公司;二甲基亞砜(DMSO)為上海生工生物工程公司Amresco進口分裝。SW-CJ-2F標準型凈化工作臺;倒置顯微鏡(Olympus，BX60);美國Thermo Scientific Forma seriesⅡ水套CO2培養箱;XK96-Ⅰ型微量振蕩器;Model∑960型酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測HSC的增殖情況 HSC-T6細胞37℃復蘇，用含10%小牛血清的DMEM高糖培養液，置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱內培養，至少傳代培養一代后，將處于對數生長期的HSC配成1×105/mL細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL。將培養的HSC分為3組，空白對照組:培養孔中為培養基，作為實驗調零孔;細胞對照組:細胞加含血清培養液;龍血素B作用組:細胞加含不同濃度龍血素B液的培養液，24 h后將不同濃度的藥物(設0.500、0.400、0.200、0.100、0.050、0.025 μg/μL 6個藥物終濃度)加入培養孔，每孔100μL，各濃度均設5個復孔。對照孔均加入100μL含10%小牛血清的培養液。48 h后每孔加0.5%MTT貯存液20 μL，繼續孵育4 h后棄上清，每孔加入DMSO 150μL溶解細胞內結晶，微型振蕩器振蕩10 min，用全自動酶標儀在490 nm波長處采用比色法測定各孔OD值，測得的各復孔OD值取平均數。抑制率(IE)=(對照孔 OD490－實驗孔 OD490/對照孔 OD490×100%)。觀察藥物對細胞生長的影響，并計算藥物的半數抑制量(IC50)，以IC50為高劑量處理細胞。

1.2.2 放射免疫法檢測透明質酸(HA)、層粘連蛋白(LN)和Ⅳ型膠原(Ⅳ-C) 將HSC-T6稀釋成1.5×105/mL細胞懸液接種于24孔板，每孔1 mL，至細胞長至近單層后，加入含不同濃度龍血素B(0、0.030、0.150、0.300 μg/μL) 的培養液，每孔 200 μL，培養48 h，取上清液用放射免疫法分別檢測HA、LN 和Ⅳ-C。

1.2.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件，計量資料以ˉx±s表示，比較采用單因素變量的方差分析和最小差值顯著法(LSD-t)。P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 不同濃度龍血素B對HSC增殖的抑制作用

不同濃度龍血素B處理48 h后，HSC生長受到抑制，在0.025 ～0.500 μg/μL 的濃度范圍，抑制率隨濃度升高而升高。見表1。

2.2 龍血素B對HSC分泌HA、LN和Ⅳ-C的影響

龍血素B處理細胞后可不同程度抑制HSC分泌HA、LN 和Ⅳ-C，尤以0.300 μg/μL龍血素B 效果最佳。見表2。

3 討論

血竭為棕櫚科植物，又名麒麟竭，由果實滲出的樹脂經加工制成，為傳統名貴中藥。我國國家標準［WS3-082(Z-016)-99(Z)］中將百合科龍血樹屬植物劍葉龍血樹Dranaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen的含樹脂木材經提取得到的樹脂定名為“龍血竭”，其具有活血、化瘀、止血、補血的功效，被譽為“活血圣藥”［2］，龍血素 B(C18H20O5)是龍血竭的主要有效成分，前期試驗表明，龍血竭除了能有效地減輕肺纖維化大鼠肺組織的纖維化程度［3］外，其主要成分龍血素B還能對硫代乙酰胺誘導的大鼠肝纖維化有一定的預防和治療作用［4］。

表1 不同濃度龍血素B對HSC增殖的抑制作用(n=5，ˉx ±s)

表2 龍血素B對HSC分泌HA、LN和Ⅳ-C的影響(ˉx ± s)

HSC激活是肝纖維化發生、發展的中心環節和共同通路。HSC在慢性肝損傷時被激活，并同時分泌多種細胞因子促進自身的活化。在HSC激活的持續階段，細胞外基質(ECM)重建繼續進行，ECM合成增加而降解減少，并逐漸被富含纖維的膠原所替代，纖維化進一步加重。抑制HSC的激活或促進激活的HSC凋亡有望成為抗肝纖維化的新途徑。本實驗體外研究顯示，經龍血素B處理48 h后，HSC 生長受到抑制，在 0.025～0.500 μg/μL 的濃度范圍，抑制率隨濃度升高而升高。說明龍血素B可劑量依賴性地抑制HSC的增殖。

HA為基質成分之一，由間質細胞合成，是反映肝損害嚴重程度、判斷有無活動性肝纖維化的定量指標，可較準確靈敏地反映肝內已生成的纖維量及肝細胞受損狀況。Ⅳ-C是構成基底膜的主要成分，在肝纖維化時出現最早，合成和降解都處于較高水平，反映基底膜膠原更新率，其含量增高可較靈敏反映出肝纖維化過程，是肝纖維化的早期標志之一。LN為基底膜中特有的非膠原性結構蛋白，可以反映肝纖維化的進展與嚴重程度，與肝纖維化活動程度及門靜脈壓力呈正相關。血清HA、Ⅳ-C、LN聯合檢測可對肝纖維化程度的判定、肝硬化的早期診斷具有一定的臨床意義，是判斷肝纖維化的敏感可靠指標［5］。本實驗結果顯示，龍血素B能不同程度地降低HSC細胞上清中HA、LN、Ⅳ-C的含量。

綜上所述，龍血素B可抑制HSC活化及增殖，并抑制ECM的合成、促進其降解，對肝纖維化有一定的防治作用。

［1］Guo J，Friedman SL.Hepatic fibrogenesis［J］.Semin Liver Dis，2007，27(4):413-426.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［S］.北京:化學工業出版社，2000:110.

［3］聶莉，程德云，朱剛艷.龍血竭對肺纖維化大鼠肺組織轉化生長因子β1mRNA及Ⅰ型膠原蛋白表達的影響［J］.河北中醫，2010，32(7):1071-1072.

［4］彭偉，范紅，宋正己.龍血素B對實驗性肝纖維化的干預作用及機制［J］.中華消化雜志，2010，30(2):129-130.

［5］劉曉強，周海中，吳靖珍.肝病患者血清 HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN測定的臨床意義［J］.實用臨床醫藥雜志，2009，13(6):40-42.