YB-1抑制三氧化二砷誘導的胃癌細胞自噬機制

龍璐璐，許文林，沈慧玲，冷加燕

(江蘇大學附屬人民醫院中心實驗室，江蘇鎮江212002)

自噬是細胞的一種可調控的溶酶體降解過程，通過降解長壽命蛋白、部分細胞器等以實現自身代謝需要和細胞器的更新［1］。近年研究發現，腫瘤細胞的自噬和自噬性細胞死亡在一些治療條件下可以被激活［2，3］，在腫瘤的發生發展及治療中的作用越來越受到關注。Y-box結合蛋白-1(YB-1)是Y-box結合蛋白家族成員之一，參與基因的轉錄翻譯、DNA修復、細胞增殖與再生、藥物的耐藥和細胞應激反應等多種生物過程。本實驗室前期研究發現小劑量的As2O3可以誘導腫瘤細胞自噬，YB-1可以抑制As2O3誘導的自噬［4］。為進一步探討YB-1抑制自噬的分子機制，2011年3月～2011年12月，本研究應用As2O3模擬細胞損傷模型，利用 RNA干擾(RNAi)技術部分沉默或過表達人胃癌BGC-823細胞中的YB-1基因，觀察 As2O3在BGC-823細胞自噬中的作用，并初步闡明其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌BGC-823細胞由本實驗室保存。As2O3購自哈爾濱伊達藥業。HA14-1購自美國Calbiochem公司。單丹磺酰戊二胺(MDC)購自Sigma公司。胎牛血清購自杭州四季青，人DMEM培養基購自GIBCO公司。RNA提取試劑盒購自上海生工公司，反轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒、蛋白提取試劑盒購自TaKaRa公司。HRP標記的羊抗兔、鼠二抗均購自北京康為世紀生物公司。兔抗人YB-1、Bcl-2、Beclin1、LC3 抗體，鼠抗人 P62、actin 抗體，均購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、轉染及分組 人胃癌BGC-823細胞以1×106接種在培養瓶中，用含有10% 胎牛血清DMEM培養基，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養。按照實驗設計分組:空白對照(control)組、空質粒(HK)組、干擾質粒(siYB-1)組、空病毒(AdGFP)組、pAd1Easy/YB1腺病毒表達載體(AdYB-1)組，使用LipofectamineTM2000脂質體轉染后24 h，鑒定轉染效率。

1.2.2 HA14-1的制備及分組 HA14-1是Bcl-2的小分子配體，可與Bcl-2蛋白結合而降低其生物學活性。將該化合物以104μmol/L的濃度溶解于DMSO中，－70℃避光保存。根據實驗設計將BGC-823細胞分為三組:AdGFP組、AdYB-1組、HA14-1組(AdYB-1轉染后加入50μmol/L的HA14-1作用4 h)。

1.2.3 qRT-PCR檢測Bcl-2和Beclin1的基因表達

Trizol法提取各組BGC-823細胞的總RNA，逆轉錄為cDNA，美國BIO-RAD熒光定量PCR儀擴增分析。Bcl-2基因上游引物:5'-GGAGGATTGTGGCCTTCTTTG-3'，下 游 引 物:5'-GGTGCCGGTTCAGGTACTCA-3'。Beclin1基因上游引物:5'-ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3'，下游引物:5'-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG-3'。β-actin為內參，上游引物:5'-CTCGCGCTACTCTCTCTTTC-3'，下游引物:5'-CATGTCTCGATCCCACTTAAC-3'。

1.2.4 MDC染色觀察細胞自噬泡的聚集 BGC-823細胞以每孔5×104接種于24孔板中，按照實驗分組。轉染24 h后加入4μmol/L As2O3處理24 h，4%多聚甲醛固定，50μmol/L的MDC孵育。激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞自噬空泡的積聚。

1.2.5 Western blot檢測 Beclin1、P62、LC3 蛋白表達 收集各組 BGC-823細胞，RIPA裂解細胞，12 000 r/min，4℃離心，SDS-PAGE分離蛋白，轉移到PVDF膜上。1%BSA封閉 2 h。YB-1抗體(1∶200)、Bcl-2 抗 體 (1 ∶500)、Beclin1 抗 體(1∶800)、P62 抗體(1∶300)、LC3 抗體(1∶3 000)4℃孵育過夜。HRP標記羊抗兔二抗(1∶5 000)、羊抗鼠二抗(1∶5 000)孵育1 h。凝膠成像系統拍照分析。以β-actin為內參，以靶蛋白積分光密度(IOD)值與β-actin IOD值的比值反映靶蛋白相對水平。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，數據均用xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間差異比較采用q檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組YB-1的表達 與HK組和AdGFP組相比，siYB-1組YB-1蛋白表達明顯降低，AdYB-1組YB-1蛋白表達明顯升高。見圖1。

圖1 轉染siYB-1和AdYB-1后YB-1的表達

2.2 各組 Bcl-2、Beclin1基因表達水平比較 與AdGFP組和HK組相比，AdYB-1組Bcl-2/β-actin基因相對表達量明顯增加(P＜0.05)，siYB-1組Bcl-2/β-actin表達降低(P＜0.05)。見圖2。各轉染組Beclin1/β-actin基因相對表達量無統計學差異。

圖2 qRT-PCR檢測Bcl-2/β-actin基因相對表達量

2.3 各組 Bcl-2、Beclin1蛋白表達水平比較 與AdGFP組和HK組相比，Bcl-2蛋白表達在AdYB-1組升高，在siYB-1組降低;而 Beclin1蛋白表達在AdYB-1組明顯降低，siYB-1組顯著升高(P均 ＜0.01)。見圖3A。自噬水平檢測顯示，AdYB-1組P62蛋白聚集增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ降低(P ＜0.01)，抑制了自噬;應用siYB-1干擾YB-1表達后，促進了自噬的發生。

2.4 HA14-1對YB-1抑制自噬的影響 MDC染色結果顯示，與AdGFP組相比，AdYB-1組自噬泡聚集減少，而轉染AdYB-1后加入HA14-1處理后，自噬泡重新聚集。Western blot檢測結果顯示，與AdGFP組相比，AdYB-1組Beclin1蛋白表達降低，P62蛋白聚集增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ減少，自噬水平降低。轉染AdYB-1并加入HA14-1后，Beclin1蛋白恢復表達，P62蛋白降解增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ重新升高。見圖3B。提示HA14-1可能通過抑制Bcl-2的活性、上調Beclin1的表達影響YB-1對As2O3誘導的BGC-823細胞自噬的活性。

圖3 Western blot檢測蛋白結果

3 討論

自噬廣泛存在于真核細胞的病理生理過程中，在維持細胞穩態和促進細胞生存方面起重要作用［5］。近年研究發現As2O3可誘導多種腫瘤細胞發生自噬及自噬性細胞死亡。本實驗室的前期研究也發現As2O3可誘導BGC-823細胞自噬的發生。

YB-1是腫瘤細胞生存的一個正調控因子。YB-1的表達可以促進腫瘤細胞增殖，介導腫瘤細胞抗凋亡及產生耐藥等［6］。但是有關YB-1抑制自噬的研究并未見報道，本實驗室的前期研究首次揭示YB-1可以抑制As2O3誘導的腫瘤細胞自噬。提示YB-1作為一個癌基因和抗細胞死亡的分子，在腫瘤的進程中可能參與更廣泛的病理過程，其抑制As2O3誘導的自噬的功能可能為腫瘤發生發展及治療提供新的理論依據。本實驗采用RNAi技術部分沉默或過表達YB-1，探討YB-1抑制As2O3誘導的BGC-823細胞自噬的分子機制。

Beclin1是調節細胞自噬過程的關鍵基因之一，其機制主要是與Ⅲ型PI3K形成復合物，參與募集胞質中含有FYVE或PX基序的蛋白質，調節前自噬體的形成及自噬蛋白在自噬體膜上的定位過程［7］。Pattingre等［8］研究表明，抗凋亡蛋白 Bcl-2能夠與Beclin1形成復合物，抑制Beclin1依賴的自噬。本研究發現Bcl-2與YB-1抑制As2O3誘導的BGC-823細胞自噬相關，并且加用Bcl-2抑制劑HA14-1使Bcl-2失活后，Beclin1表達下調，減弱了YB-1對自噬的抑制作用。提示YB-1對As2O3誘導的BGC-823細胞自噬的抑制作用可能是通過上調了Bcl-2的表達，從而抑制Beclin1而實現的。

［1］Paglin S，Hollister T，Delohery T，et al.A novel response of cancer cells to radiation involves autophagy and formation of acidic vesicles［J］.Cancer Res，2001，61(2):439-444.

［2］Kanzawa T，Germano IM，Komata T，et al.Role of autophagy in temozolomode-induced cytotoxicity for malignant glioma cells［J］.Cell Death Differ，2004，11(4):448-457.

［3］Edinger AL，Thompson CB.Death by design:apoptosis，necrosis and autophagy［J］.Curr Opin Cell Biol，2004，16(6):663-669.

［4］冷加燕，許文林，沈慧玲，等.YB-1腺病毒載體的構建及其對乳腺癌MCF-7細胞耐藥性的影響［J］.江蘇大學學報(醫學版)，2011，21(4):33-37.

［5］ Lockwood TD，Minassian IA.Protein turnover and proliferation.Failure of SV-3T3 cell to increase lysosomal proteinases，increase protein degradation and crease net protein accumulation［J］.Biochem J，1982，206(2):215-218.

［6］Uramoto H，Izumi H，Ise T，et al.p73 interacts with cMyc to regulate Y-box-binding proyein-1 expression［J］.J Biol Chem，2002，277(35):31694-31702.

［7］Meijer AJ，Codogno P.Regulation and role of autophagy in mammalian cells［J］.Int J Biochem Cell Biol，2004，36(12):2445-2462.

［8］Pattingre S，Tasssa A，Qu X，et al.Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy［J］.Cell，2005，122(6):927-939.