腦癱患者骨髓間充質干細胞體外培養特性分析

王亞莉，陳國軍，方 鳳，陳 麗，張 青，劉厚奇

(1浙江武警總隊醫院，浙江嘉興314000;2第二軍醫大學發育生物學研究所)

間充質干細胞因具有強大的分化能力和組織修復能力廣泛用于腦癱的治療。據報道，骨髓間充質干細胞(Human marrow mesenchymal cells，hMSCs)可在體外成功培養、分化為神經干細胞、血管內皮細胞、肝細胞、軟骨組織、骨組織等［1］，發揮修復損傷組織的作用。自2010年12月以來，我院開始采用自體hMSCs體外轉化神經干細胞治療腦癱，取得較好效果。現對hMSCs體外培養生長特性進行分析，旨在指導臨床把握治療時機和提高種子細胞質量，提高治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料 MSC培養基(含DMEM、MCDS、優級FBS、LAA，Sigma 公司)，0.05%Trypsin-EDTA(GIBCO公司)，PBS緩沖液，bFGF，倒置顯微鏡，CD34、CD109、CD29、CD44 單抗，大皿(100 mm)、中皿(60 mm)培養皿。38份骨髓樣本取自38例腦癱患者［(男22例，女16例，年齡1～35歲;其中1～3歲11例(嬰幼兒組)、4～6歲9例(學齡前組)、7～19歲10例(學齡組)，20～35歲8例(成人組)］。患者均簽署知情同意書，通過醫院倫理委員會審批。

1.2 hMSCs原代細胞(P0)分離培養 各組均根據0.6～1 mL/kg體質量于右側髂后上嵴采集骨髓12～50 mL，骨髓收集管中按100 U/mL加入肝素抗凝，骨髓樣分裝到多支15 mL離心管，每管5 mL，加入等量PBS溶液，配平，離心7 min，1 000 r/min。離心結束小心取出，用移液管抽取上層液體，棄掉，用吸管抽取中間白膜層(盡量少帶入紅細胞)，抽至新管內，加入PBS清洗2次，用培養基重懸后倒入培養皿中。根據骨髓量的多少以及白膜層是否明顯決定放入大皿或中皿。置37℃、5%CO2飽和濕度孵箱內孵育，48 h半量換液，4 d后全量換液，棄去大量的懸浮細胞，以后每3～4 d根據培養基顏色換液。

1.3 原代及傳代細胞生長形態特征及細胞增長速率計算 原代細胞一般在分離后6～9 d傳代1次，P1以后于細胞生長達到覆蓋培養皿的60% ～80%后予1∶2或1∶3傳代。從第2代以后，每次傳代時行hMSCs鑒定:棄去上清，用PBS清洗2次，滴加0.05%的Trypsin-EDTA胰酶消化，顯微鏡下觀察細胞觸角收縮，細胞變成圓形后，添加培養基終止消化，制成(1～3)×106/mL的細胞懸液分裝于不同培養皿中，3～4 d根據培養基顏色換液。流式細胞儀檢測示CD34、CD109陰性，CD29和CD44陽性率均＞90%證實為hMSCs。倒置相差顯微鏡逐日觀察原代及傳代細胞生長情況和形態特征。并計算各組細 胞 增 長 速 率，細 胞 增 長 速 率 =(傳代天數

1.4 統計學方法 采用SPSS10.0統計軟件進行統計分析，計量數據以xˉ±s表示、行t檢驗，率的比較行 χ2檢驗，檢驗水準 α =0.05。

2 結果

P0第2天可見貼壁生長，先呈圓點形，逐漸伸出觸角成梭形，原代細胞貼壁較慢，24 h后逐漸貼壁，換液培養，貼壁細胞漸形成集落。嬰幼兒組、學齡前及學齡組hMSCs形成集落明顯，細胞數較多，細胞呈長梭形較集中，生長速度快;成人組hMSCs形成集落小，細胞數較少，細胞較大呈短梭形散在分布。各組細胞成簇生長，在雜質細胞較多時培養基由鮮紅轉為暗紅，當第4天全量換液后雜質細胞減少，培養皿中呈現培養基本身的粉紅色，呈簇生長的細胞簇面積增大，中心較密集，似菊花狀。各組于6～9 d進行傳代第1次(P1)，P1以后的細胞在培養皿中呈均勻分布，生長速率逐漸增快。各組細胞傳代時間情況見表1，細胞增長速率比較見表2。

表1 各組細胞傳代時間(d，ˉx±s)

表2 各組細胞增長速率(%，ˉx±s)

3 討論

hMSCs具有可分離并體外培養與擴增的特性，組織修復性能好。大量研究證實間充質干細胞可轉化為神經干細胞修復腦損傷［2，3］，而患者間充質干細胞的實驗室細胞工程質量是關鍵因素，骨髓hMSCs的含量、質量、活性等隨著年齡的增長而下降［4，5］。陳國軍等［6］曾對 11 個月 ～3 歲、4 ～20 歲、21歲～40歲以及41～60歲的20例患者的hMSCs體外培養增殖速度與傳代時間進行觀察，發現40歲以內患者首次傳代時間無明顯差異，＜20歲者P1傳代時間明顯短于＞20歲者，且培養達到治療數量細胞所需時間明顯短于＞20歲者。

本研究結果顯示，腦癱患者無論年齡大小，其hMSCs均可成功于體外分離、培養、擴增。原代細胞貼壁較慢，且貼壁不穩固，可能因培養皿中有較多的紅細胞等其余雜質細胞，影響間充質干細胞的貼壁，故半量換液或全量換液過程中動作一定要輕柔，切忌劇烈晃動，以免影響細胞的貼壁生長;貼壁后的細胞呈簇生長，在培養皿中不是均勻鋪開，所以一般6～9 d無論細胞生長是否覆蓋培養皿的60%以上均應給予傳代，否則細胞聚集在一起出現老化現象。原代細胞傳代時，呈簇生長的細胞被吹散開來，輕輕晃動培養皿，使細胞均勻覆蓋培養皿，有利于細胞的貼壁增殖。經過首次傳代后大量的紅細胞已被清除，P1以后的細胞在培養皿中呈均勻分布，培養基澄清透明容易觀察細胞的生長狀態。研究發現，兒童的hMSCs與成人相比倍增時間短，形成的集落多，其 MSCs用于組織工程和細胞治療較為理想［7，8］。本研究亦發現，＜20歲的3個年齡組 hMSCs生長速度均明顯快于成人組，P1～P2代細胞增殖速度較快，傳代需要的時間短，P3～P4代細胞增長速率逐漸減慢。而成人組hMSCs細胞快速生長期不明顯。

綜上所述，腦癱患者自體hMSCs是理想的種子細胞，具有取材方便，易于培養、擴增的優點;＜20歲者的hMSCs培養速度快，生長效率高，在短時間內培養可獲取足夠細胞數。

［1］李洪偉，郭今開，周冰，等.人骨髓間充質干細胞體外培養及其生物學特性［J］.山東醫藥，2011，51(26):91-93.

［2］Titomanlio L，Kavelaars A，Dalous J.Stem cell therapy for neonatal brain injury:perspectives and challenges［J］.Ann Neurol，2011，70(5):698-712.

［3］Chen A，Siow B，Blamire AM.Transplantation of magnetically labeled mesenchymal stem cells in a model of perinatal brain injury［J］.Stem Cell Res，2010，5(3):255-266.

［4］Tokalov SV，Gruener S，Schindler S.A number of bone marrow mesenchymal stem cells but neither phenotype nor differentiation capacities changes with age of rats［J］.Mol Cells，2007，24(2):255-260.

［5］Iagunov AS，Baumann M，Abolmaali ND，et al.Effect of maturation on the osteogonic response of cultured stromal bone marrow cells to basic fibroblast growth factor［J］.Bone，2000，27(6):777-783.

［6］陳國軍，王亞莉，方鳳，等.不同年齡患者骨髓間充質干細胞體外生長特性［J］.國際檢驗醫學雜志，2011，32(19):2189-2191.

［7］Choumerianou DM，Martimianaki G，Stiakaki E，et al.Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults［J］.Cytotherapy，2010，12(7):881-887.

［8］王海峰，李魯生，張涵，等.腦癱患者骨髓間充質干細胞傳代過程中細胞表型和所分泌細胞因子變化特點［J］.武警醫學，2011，22(3):199-202.