中國廣西人群Nogo-C基因rs17046518 G/A多態性研究

藍 艷，盧 冬，王春芳，潘國剛，韋葉生

(右江民族醫學院附屬醫院，廣西百色533000)

Nogo基因是新近發現的軸索生長抑制因子(Neurite growth inhibitor)，具有抑制中樞神經再生的作用［1］。RTN4基因存在多個位點的基因多態性，與頸部的鱗狀細胞癌、室間隔缺損、精神分裂癥、抑郁癥、擴張性心肌病發生的關系是目前研究熱點［4～7］。Nogo-C 是RTN4家族中重要成員之一，在3'-非翻譯區存在rs17046518 G/A單核苷酸多態性。目前，有關Nogo-C基因rs17046518 G/A多態性的研究國內外尚未見文獻報道。2011年1～12月，我們采用單堿基延伸PCR技術研究了廣西地區健康人群Nogo-C基因3'-非翻譯區單核苷酸多態性，并與人類基因組計劃(Hapmap)公布的四個人群(歐洲人、非洲人、日本人和中國北京人)的單核苷酸多態性(SNP)分型數據進行比較，旨在探討Nogo-C基因3'-非翻譯區基因多態性在不同種族正常人群中的分布差異，為人類學及群體遺傳學研究提供前瞻性基礎資料。

1 資料與方法

1.1 研究對象 隨機選取廣西地區無血緣關系的個體199例，其中男118例，女81例;年齡25～86歲。均為廣西右江民族醫學院附屬醫院體檢健康者，各項臨床及實驗室檢查指標均正常。

1.2 Nogo-C基因型檢測 采集受檢者靜脈血2 mL，用EDTA-K2抗凝;采用改良碘化鈉法提取白細胞基因組DNA，－70℃保存備用。采用單堿基延伸PCR技術檢測Nogo-C基因3'-非翻譯區rs17046518 G/A位點多態性的分布:根據 Nogo-C基因rs17046518 G/A位點多態性與已知的DNA序列設計PCR引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。用于特異性擴增Nogo-C基因包含rs17046518 G/A位點堿基的DNA片段的引物，上游引物序列:5'-AGGGGTGTGGGGAGGAGTGACA-3'，下 游 引 物 序列:5'-GGGGGTGGCATGAAACACAATGA-3'，延伸引物:5'-GGGGGGTCGATGTGAGGCAGGTAGGAAGAA-3'。Nogo-C的PCR擴增反應體系為20μL，其中含10 × PCR 緩沖液 2.0 μL，0.3 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各 1.0 μL，模板 DNA 1.0 μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，不足體積用滅菌雙蒸水補足至20μL。PCR產物用Qiagen公司的HotStarTaq進行多重PCR獲得，PCR產物經蝦堿酶(SAP)(from Promega)和外切酶I(EXO I)(from Epicentre)純化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進行延伸反應。延伸產物用SAP純化后在ABI3130XL上樣。SNP分型用 GeneMapper4.0(Appliedbiosystems)分析。將Nogo-C基因rs17046518 G/A多態性分布頻率與人類基因組計劃 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)公布的四個人群(歐洲人、非洲人、日本人和中國北京人)的SNP分型數據進行比較。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.5軟件包進行分析。基因型和等位基因頻率采用基因直接計數法計算，各組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

PCR擴增產物片段大小為 247 bp。經ABI3130XL基因檢測儀SNP分型結果顯示rs17046518 G/A位點檢測到AA、GA和GG三種基因型。基因測序進一步證實該結果(圖1)。Nogo-C基因rs17046518 G/A位點的基因型及等位基因頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，即所選的研究樣本具有群體代表性。其中rs17046518 G/A位點基因型以AA型最為常見，占69.8%;其等位基因以A型頻率最高，占82.4%。其基因型及等位基因頻率分布在男女性別間比較無顯著性差異 (表1)。Nogo-C基因多態性基因型及等位基因的分布頻率與歐洲人和非洲人比較差異均有顯著性(P均＜0.05)，而與日本東京人和中國北京人比較差異無顯著性(表2)。

圖1 Nogo-C基因rs17046518 G/A測序圖

表1 Nogo-C基因型及等位基因頻率在廣西地區人群中的分布

表2 不同種族及地區人群Nogo-C基因rs17046518 G/A多態性分布頻率比較

3 討論

Nogo是在中樞神經系統髓磷脂中發現的一種抑制軸突生長的蛋白，編碼Nogo蛋白的基因被稱為Nogo基因。由于啟動子和mRNA剪切方式不同，Nogo基因能表達出3種mRNA的轉錄體，其編碼的蛋白質分別為Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C，三者均屬于網狀蛋白(Reticulon protein，RTN)家族第四成員［2］。Nogo-C相對分子質量最小，由199個氨基酸殘基組成，在中樞神經系統中主要分布于星形膠質細胞，外周組織中大部分存在于骨骼肌細胞及脂肪細胞，心臟中亦有少量分布，在抑制神經再生、介導細胞凋亡及參與腫瘤發生等過程中起重要作用［8～10］。Nogo-C 基因位于 2 號染色體短臂上(2p13-14)，編碼基因為 RTN4［3］，由 7 個外顯子和 6個內含子組成，Nogo-C基因 3'-非翻譯區存在rs17046518 G/A單核苷酸多態性，這種基因多態性的存在可能影響Nogo-C基因功能，進而可能影響到Nogo-C基因多態性與相關疾病的發生發展。因此，正確分析和闡明Nogo-C基因多態性在不同種族和地域人群中的分布特點，可為進一步研究不同人群中Nogo-C基因多態性與某些疾病發生發展間的關系提供理論依據和分子遺傳學基礎。

本研究發現，rs17046518 G/A位點表現出AA、GA和GG 3種基因型，以AA型最為常見，其等位基因以A最為常見。進一步分析發現Nogo-C基因rs17046518 G/A位點基因型及等位基因分布頻率在男女組間比較無顯著性差異，提示該位點基因型及等位基因分布頻率可能與性別無相關性。比較分析發現，我國廣西健康人群中 Nogo-C基因rs17046518 G/A位點G等位基因頻率顯著高于歐洲人和非洲人;與日本人和中國北京人群比較差異無顯著性，提示Nogo-C基因型分布及等位基因頻率在不同種族間存在明顯差異，這一結果符合遺傳學規律，即親緣關系越近，其基因型分布越相似，反之則差異越顯著。

綜上所述，中國廣西人群 Nogo-C基因rs17046518 G/A位點表現出AA、GA和GG 3種基因型，以AA型最為常見，其等位基因以A最為常見，與性別無相關性。Nogo-C基因型分布及等位基因頻率在不同種族間存在明顯差異，符合遺傳學規律。對中國廣西人群Nogo-C基因rs17046518 G/A多態性研究不僅有利于認識臨床與Nogo-C基因相關的多種疾病在不同種族和地域表現出來的差異，而且為進一步人類學及群體遺傳學的研究和基因多態性普查奠定了基礎，并為進行疾病前瞻性研究提供了重要的分子遺傳學數據。

［1］Yates D.Neural development:Nogo to synapse formation［J］.Nat Rev Neurosci，2012，13(4):221.

［2］Oertle T，Huber C，van der Putten H，et al.Genomic structure and functional characterisation of the promoters of human and mouse nogo/rtn4［J］.J Mol Biol，2003，325(2):299-323.

［3］Yang J，Yu L，Bi AD，et al.Assignment of the human reticulon 4 gene(RTN4)to chromosome 2p14--＞2p13 by radiation hybrid mapping［J］.Cytogenet Cell Genet，2000，88(1-2):101-102.

［4］Shi S，Zhou B，Wang Y，et al.Genetic Variation in RTN4 3＇-UTR and Susceptibility to Cervical Squamous Cell Carcinoma［J］.DNA Cell Biol，2012 Feb 9.［Epub a head of print］.

［5］Chen Y，Zhou B，Li H，et al.Analysis of RTN4 3＇UTR insertion/deletion polymorphisms in ventricular septal defect in a Chinese Han population［J］.DNA Cell Biol，2011，30(5):323-327.

［6］Novak G，Tallerico T.Nogo A，B and Cexpression in schizophrenia，depression and bipolar frontal cortex，and correlation of Nogo expression with CAA/TATC polymorphism in 3＇-UTR［J］.Brain Res，2006，1120(1):161-171.

［7］Zhou B，Rao L，Li Y，et al.The association between dilated cardiomyopathy and RTN4 3 ＇UTR insertion/deletion polymorphisms［J］.Clin Chim Acta，2009，400(1-2):21-24.

［8］Kim JE，Bonilla IE，Qiu D，et al.Nogo-C is sufficient to delay nerve regeneration［J］.Mol Cell Neurosci，2003，23(3):451-459.

［9］Chen Y，Tang X，Cao X，et al.Human Nogo-C overexpression induces HEK293 cell apoptosis via a mechanism that involves JNK-c-Jun pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，348(3):923-928.

［10］Chen Y，Tang X，Zhang X，et al.New mutations of Nogo-C in hepatocellular carcinoma［J］.Mol Biol Rep，2009，36(2):377-380.