FISH痰脫落細胞檢查診斷肺癌的價值

王 飛，孟 濤，楊 佳，穆朝東

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院，烏魯木齊830011)

胸片、CT及痰細胞學檢查為目前肺癌早期的主要篩查手段，但特異性及敏感性均較低［1～3］，早期漏診率高;而大部分肺癌患者就診時病情已發展到晚期，病死率高［4］。熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是近年發展起來的一項新技術，其可迅速檢測出中期分裂相/間期核細胞中染色體數目等異常變化，為肺癌的遺傳學研究提供了新方法［5］。近期國內已有將FISH技術應用于肺癌檢測的相關報道，但多數是利用支氣管鏡取樣，而用于痰脫落細胞的報道較少。2009年4月～2011年10月，我們采用雙色FISH技術檢測了60例初診疑似肺癌患者痰液中脫落細胞3、7、17染色體和9號染色體P16位點異常情況，并以組織病理確診為肺癌為金標準，探討FISH技術在肺癌診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 60例初診疑似肺癌患者，男42例，女18例;年齡46～76歲，中位年齡63歲。長期吸煙35例，有慢性咳嗽咳痰病史47例。經病理或細胞學檢查診斷證實為肺癌43例(肺癌組)，其中鱗癌26例、小細胞肺癌6例、腺癌11例;TNM分期Ⅰ～Ⅱ期(早期)18例，Ⅲ～Ⅳ期(晚期)25例。肺良性病變17例(良性組)，其中結核10例，肺炎7例。另選取同期20例體檢健康者為對照組，年齡41～80歲，中位年齡61歲。

1.2 痰脫落細胞檢查 收集三組新鮮痰液標本(取清晨漱口后深部第2、3口痰，連續3 d，留置于無菌瓶中)，每例收集約20 mL，分為兩等分各10 mL，分別用于FISH檢測和常規痰脫落細胞學檢查(常規方法)。

1.2.1 FISH檢測 10 mL中痰液加入5～10 mL的痰液消化液，搖勻，放置10～20 min，1 500 r/min離心10 min后去上清，加入5 mL在37℃預熱的膠原酶B，37℃水浴35 min，期間吹打懸浮細胞5～6次。1 500 r/min離心10 min后去上清，加入5 mL 37℃預熱的0.075 mol/L的KCl低滲液，重新吹打懸浮細胞，37℃水浴低滲30 min，期間吹打5～6次。加入固定液2 mL(甲醇∶冰醋酸為3∶1)，混勻，1 500 r/min離心10 min后去上清。室溫下緩慢加入5 mL新的固定液重新懸浮細胞，室溫下放置10 min，1 500 r/min離心懸液10 min后去上清到原來體積的1/20～1/50(留0.5～1 mL)。將懸液靜置10 min，用移液槍滴加15～25μL細胞懸液至3～4片玻片上，自然晾干。56℃環境中老化玻片30 min或室溫下過夜老化玻片。將樣本片子放入2×標準檸檬酸鹽溶液(SSC)溶液中漂洗2次，每次5 min。0.1 mol/L HCl溶液中浸泡10 min;將片子放入已經預熱至37℃的胃蛋白酶工作液中，消化10 min。2×SSC室溫下清洗2次，每次5 min。將片子放入快速固定液(39 mL的2×SSC，1 mL的甲醛)室溫中，固定10 min。將片子依次置于70%、85%、100%的乙醇各脫水2 min。取出后，自然干燥玻片。干燥后的玻片加熱至56℃。在片子上將10μL的混合探針加到一個反應區，將蓋玻片立刻覆蓋反應區，使探針溶液彌漫整個覆蓋區。用樹膠封固，將封好的片子放入預熱的濕盒中，于76℃水浴箱中高溫變性5.5 min，取出后放入提前溫育在42℃的雜交盒中，過夜放置。將雜交后的玻片取出，揭掉表面的封口膠，將玻片放入2×SSC溶液中反復清洗，洗去蓋片后開始玻片洗滌。將玻片放入40 mL 67℃ 0.3%NP-40/0.4×SSC溶液中洗滌2 min。室溫下在40 mL 0.1%NP-40/2×SSC溶液中洗滌30 s。玻片置于室溫的70%乙醇中洗滌3 min。取出后在暗處風干，烤片機上56℃烤片3～5 min，滴加15μL DAPI于樣本區，蓋上蓋片，避光保存15～20 min。

1.2.2 對照組痰脫落細胞染色體數目畸變的閾值(畸變率)檢測 應用日本OLYMPUS2BX51型熒光顯微鏡，圖像分析系統采用俄羅斯Video Test公司FISH2.0分析軟件。對采集的20例正常人痰液每組探針組合分析100個細胞。統計出現不同異常情況的百分比，閾值=平均數(M)+3×標準差(SD)，3、7、17號染色體探針各需要建立2個閾值(1個點、≥3個點)，9p16探針需要建立3個閾值(0、1、≥3個點)。任意≥2個位點出現異常，如3號和17號染色體出現非整倍增加，可判斷為陽性;一個位點有≥2種異常，如9p16有0信號點異常和3信號點異常，也可判斷為陽性。若只有一個位點出現一種異常，擴大計數細胞后再重新判斷。統計信號種類及與之相對應細胞數目百分比并錄入圖像分析儀。在鏡下觀察雜交效果，以細胞雜交率＞80%為有效標本。細胞核膜須完整，在細胞核內可見清晰明亮的橘紅色或黃綠色熒光信號，如出現2個或3個熒光點，兩個位點之間距離大于單個信號的直徑以上，且熒光強度相近，計為含有2條或3條染色體。如果兩個信號之間的距離＜1個信號的直徑則計數為1條染色體。

1.2.3 疑似肺癌患者染色體畸變 以20例正常人痰脫落細胞染色體數目畸變的閾值(畸變率)為標準，判定疑似肺癌患者染色體畸變數。每組探針均組合分析100個細胞，計算異常率，判斷陽性個數。

1.2.4 常規方法檢測 取10 mL痰液標本行常規方法檢查，由固定的2名細胞學專家按照常規操作并判定結果。以病理檢查結果為金標準，對FISH、常規方法及二者聯合檢查診斷肺癌的價值進行分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS12.0統計軟件，實驗數據以百分比表示，采用獨立樣本t檢驗、χ2檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 20例正常人痰脫落細胞染色體數目畸變的閾值(畸變率) 見表1。

表1 20例正常人痰脫落細胞染色體數目畸變率(%)

2.2 診斷價值 FISH與常規方法診斷的敏感性分別為 65.1%(28/43)、32.5%(14/43)，P=0.003;特異性分別為 76.5%(13/17)、100%(17/17)，P=1;聯合檢測的敏感性與特異性分別為72.1%(31/43)、100%(17/17)，與常規方法比較，P分別 =0、1。FISH、常規方法判斷TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的敏感性分別為55.6%(10/18)、22.2%(4/18)，P=0.040;Ⅲ～Ⅳ期敏感性分別為72%(18/25)、40%(10/25)，P=0.025;聯合檢測判斷Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的敏感性分別為66.7%(12/18)、76%(19/25)，與常規方法比較，P 分別 =0.007、0.010;三種方法判斷不同分期患者的特異性無統計學差異。

3 討論

FISH是一種細胞遺傳學與分子生物學相結合的新技術，其采用熒光素直接標記遺傳物質DNA制備探針，與染色體或實體腫瘤及脫落細胞間期核進行雜交，通過熒光顯微鏡觀察腫瘤細胞內有無染色體數目和結構的改變;可直接用于檢測肺癌患者脫落細胞間期核染色體變化［6］。已有相關文獻報道，利用支氣管鏡檢刷取標本進行FISH檢測可明顯提高早期肺癌檢出的敏感性［7，8］;但支氣管鏡具有一定創傷性。用FISH技術對痰標本行肺癌高危人群篩查，以期對肺癌的發生進行早期干預是目前研究的熱點。近年來國內外關于FISH檢測痰脫落細胞診斷肺癌的報道較少，且結論差異較大［9，10］。本研究FISH結果顯示，3，7，17號染色體和9號染色體p16在肺癌組與良性組均發生一定數目的畸變，說明染色體畸變在肺癌發生、發展過程中起重要作用。

本研究結果顯示，FISH聯合常規方法檢測診斷肺癌的敏感性為72.1%，明顯高于常規方法，但特異性無統計學差異。Voss等［11］報道，通過支氣管鏡檢查疑似肺癌患者得到刷檢樣本，FISH及聯合方法診斷肺癌的敏感性明顯高于常規方法，特異性無統計學差異，與本研究結果一致。Varella-Garcia等［12］報道，多色熒光原位雜交技術聯合常規方法檢測診斷肺癌的敏感性明顯高于常規方法。而痰液標本取材容易，無創傷性，有助于推動FISH技術的臨床應用。

綜上所述，FISH行痰脫落細胞檢測診斷肺癌的敏感性高，與常規方法聯合應用能顯著提高準確率。但FISH檢測費用較昂貴，操作相對復雜，目前尚不能取代常規方法。

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［12］Varella-Garcia M，Kittelson J，Schulte AP，et al.Multi-target interphase fluorescence in situ hybridization assay increases sensitivity of sputum cytology as a predictor of lung cancer［J］.Cancer Detect Prev，2004，28(4):244-251.