siRNA干擾沉默EZH2基因對人肝癌HepG2細胞增殖的影響

龐玉艷，馮震博，李 佳，危丹明

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

EZH2(Enhancer of zeste homolog 2)是果蠅Zeste基因增強子的人類同源基因，為Polycomb group(PcG)基因家族的重要成員之一。PcG是進化過程中保守的染色質修飾基因，在胚胎發育、干細胞自我更新和腫瘤發生、發展中起重要作用［1］，EZH2為其核心成分，可促進細胞增殖，多項研究顯示其過量表達與結直腸癌、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤發生、發展和預后相關［2～4］。抑制沉默EZH2基因表達可能成為一種潛在的基因治療新方法。2011年3～7月，我們以小分子RNA(siRNA)干擾技術通過Lipofectamine2000脂質體轉染靶細胞，沉默靶基因EZH2，在細胞和蛋白水平上觀察siRNA對EZH2基因表達的影響，旨在為肝癌的基因治療提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌HepG2細胞株、流式細胞周期檢測試劑盒、細胞培養基DMEM均購自KeyGEN，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料所，MTT試劑盒、細胞總蛋白抽提試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(Bryotime)，Lipofectamine2000、TRizol試劑(Invitrogen)，ReverTra Ace-α First Strand cDNA Synthesis Kit及SyBR Green Real Time PCR Master MIX購自日本東洋紡(TOYOBO)生物科技(上海)有限公司。兔抗人β-actin多克隆抗體、兔抗人EZH2多克隆抗體(Epitomics公司)，EZH2 siRNA、Negative control FAM(N.C-FAM)均由上海吉瑪公司合成。

1.2 細胞培養及干預 將HepG2細胞株置于含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養液中，于37℃、5%CO2條件下培養，實驗時取處于對數生長期的細胞進行轉染。將細胞按照每孔(0.5～1.0)×104/mL細胞濃度接種96孔板及每孔(1.0～1.5)×105/mL細胞濃度接種6孔板，于37℃、5%CO2孵箱培養至轉染當天細胞融合率為30%～50%。將細胞隨機分為轉染組、陰性對照組及空白對照組，轉染組、陰性對照組按照 Lipofectamine2000使用說明分別瞬時轉染 EZH2 siRNA(序列為 5'-GGGAAAGUGUAUGAUAAAUTT-3')、FAM(序列為 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3')，轉染6 h后更換培養液繼續培養，24 h在熒光顯微鏡下可看到少許綠色熒光，48 h綠色熒光明顯即轉染成功。空白對照組不予任何干預。

1.3 觀察指標

1.3.1 細胞增殖活性 轉染后第24、48、72和96小時分別進行MTT檢測。每孔加入10μL MTT溶液(5 mg/mL)，在細胞培養箱內繼續孵育4 h后小心棄上清且加入DMSO溶解紫色結晶。用酶標儀于490 nm處測定吸光度。實驗重復3次，取其均值，繪制生長曲線。

1.3.2 細胞周期 轉染后48 h收集濃度1.0×106/mL單細胞懸液，PBS洗滌細胞1次，每管加入100μL Rnase A 37℃水浴30 min，再加入400μL PI染色混勻，4℃避光30 min。應用流式細胞技術分析各組細胞周期時相分布。實驗重復3次，計算平均值。

1.3.3 細胞凋亡率 轉染后48h用PBS洗滌細胞2次，離心2000r/min，5min，收集(1～5)×105/mL細胞，每管加入300μLBindingBuffer懸浮細胞，再加入5μLAnnexinV-FITC混勻，加入5μL的PropidiumIodide，混勻，室溫，避光，反應15min。應用流式細胞儀檢測各時段癌細胞凋亡分布。實驗重復3次。

1.3.4 EZH2mRNA表達 各組細胞培養至48h后抽提總RNA，逆轉錄反應體系體積20μL，內含1 μg總RNA、5×RT緩沖液4μL、dNTPMixture(各10 μmol/L)2μL、RNA 酶抑制劑1 μL、Oligo(dT)(10 pmol/μL)1μL和逆轉錄酶1μL，其余以DEPC水補足;混勻后短暫離心，42℃ 60min，95℃ 10min逆轉錄成cDNA。以各組cDNA作為模板，于熒光定量PCR儀上進行qRealtime-PCR，根據相對定量2－△△Ct方法計算各組EZH2mRNA表達水平的相對比值。1.3.5 EZH2蛋白表達 收集培養48h后的各組細胞，抽提總蛋白，利用BCA試劑盒測定蛋白濃度，以每泳道20μg濃度的蛋白樣品上樣，SDS-PAGE電泳、轉膜，經過封閉、一抗(兔抗人EZH2多克隆抗體1∶1000)孵育過夜、PBST洗膜、HRP標記鼠抗兔二抗(1∶5000)，室溫1h，PBST洗膜等步驟后，曝光掃描圖片。以β-actin作為內參照分析與EZH2條帶灰度值的比值，檢測EZH2蛋白表達變化。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計量數據以ˉx±s表示，組間比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，兩組數據比較采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖活性 轉染組于48h出現細胞增殖活性受抑，72、96h抑制作用逐漸明顯(圖1)，與陰性對照組及空白對照組比較，P均＜0.01;陰性對照組與空白對照組各時點細胞增殖活性比較均無明顯差異。未觀察到各組細胞明顯形態學改變。

圖1 各組細胞增殖活性

2.2 細胞周期 轉染48h后轉染組G0/G1期細胞數為(77.7±4.3)%，S 期細胞數(12.25 ±1.2)%，陰性對照組G0/G1期細胞數為(64.89±3.5)%，S期細胞數(23.13±2.7)%，而空白對照組G0/G1期為(63.52 ±3.5)%，S 期為(24.09 ±3.2)%，轉染組較陰性對照組及空白對照組G0/G1期細胞數明顯增多，S期細胞數明顯增少，P均＜0.01，陰性對照組與空白對照組細胞周期比較無明顯差異。

2.3 細胞凋亡率 轉染48h后轉染組、陰性對照組與空白對照組凋亡率分別為(43.97±4.1)%、(22.03 ±1.3)%、(24.05 ±2.7)%，轉染組與陰性對照組及空白對照組比較，P均＜0.01;陰性對照組與空白對照組比較無明顯差異。

2.4 EZH2mRNA和蛋白表達 HepG2細胞轉染48h后，轉染組、陰性對照組與空白對照組EZH2 mRNA 表達水平分別為 0.98 ±0.03、1.44 ±0.30、2.11±0.35(圖2)，轉染組與陰性對照組及空白對照組比較，P均＜0.01;轉染組、陰性對照組與空白對照組EZH2蛋白表達水平分別為0.35±0.12、0.90 ±0.27、0.95 ±0.30(圖 3)，轉染組與陰性對照組及空白對照組比較，P均＜0.05，陰性對照組與空白對照組EZH2mRNA和蛋白表達比較均無明顯差異。

圖2 各組細胞EZH2mRNA表達

圖3 各組細胞EZH2蛋白表達

3 討論

RNA干擾(RNAinterference，RNAi)指由非編碼小分子 RNA(siRNA、microRNA)誘導的、通過靶向沉默基因mRNA正常表達來調控細胞的分裂行為，長度為21～24nt，經RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)催化形成RNA沉默復合物(RISCs)，并與靶基因mRNA堿基互補相結合，影響靶基因的翻譯［5］。Cao等［6］認為 EZH2 作為 PcG 基因家族的核心成員，依賴EZH2蛋白完整的SET結構域對核小體組蛋白H3的27位賴氨酸進行甲基化修飾形成二甲基或三甲基(H3K27me2/me3)而發揮沉默下游目的抑癌基因如 E-cadherin、p16INK4α等的作用［7，8］。針對 EZH2在腫瘤發生、發展過程中的重要作用，目前研究已顯示在膀胱癌、胃癌等腫瘤中利用RNAi技術可抑制腫瘤細胞的增殖及侵襲力［9，10］，并發現EZH2在不同腫瘤細胞中的促增殖能力可能存在差異。

已有研究顯示EZH2在肝癌(HCC)組織中較癌旁及正常肝組織中表達明顯增高［9］，本實驗將EZH2 siRNA成功轉染入HepG2細胞內沉默EZH2基因表達，結果顯示隨時間推移，肝癌細胞增殖呈明顯抑制趨勢，抑制效應于轉染后48 h顯現，并持續48 h以上，且細胞周期發生改變，多數細胞停滯于G0/G1期，細胞增殖活性下降，誘導凋亡增加;EZH2 mRNA和蛋白表達均呈現明顯下調趨勢，證實EZH2 siRNA具有抑制肝癌細胞中EZH2基因表達的作用。可見RNAi技術可成功干擾肝癌細胞株HepG2中EZH2表達，從而抑制肝癌細胞增殖，促進癌細胞凋亡。

細胞周期的調控失衡為腫瘤發生、發展的重要機制之一，是多基因突變、多環節失控的結果。G1/S期過渡階段是細胞周期中較敏感的時期，易受外界因素的影響而發生異常，而pRB/E2F調節通路恰處于G1/S期調控的核心位置。在細胞周期G1期的早中期，去磷酸化的pRB結合于E2F的轉錄激活區，抑制E2F的轉錄活性，從而阻止了靶基因的轉錄;而當細胞進入G1后期時，去磷酸化的pRB被cyclinD/cdk4/cdk6催化并磷酸化，pRB磷酸化而釋放出E2F，激活靶基因和細胞周期進程所需的諸多基因的轉錄［11］。EZH2的編碼產物屬于Polycomb抑制復合體2(PRC2/3/4)的成員，是轉錄因子E2F的靶基因［12］。E2F與 EZH2的啟動子結合，導致EZH2高表達，并通過EZH2對核小體組蛋白H3的27位賴氨酸進行甲基化修飾，發揮沉默下游抑癌基因的作用，最終引起細胞周期調控失衡，促進細胞無規律增殖。因此，利用EZH2 siRNA沉默靶基因EZH2表達，抑制EZH2對下游抑癌基因的沉默作用，可影響腫瘤細胞的增殖與凋亡。

綜上所述，EZH2在肝癌發生、發展中起重要作用，利用siRNA技術可抑制EZH2表達，從而抑制人肝癌細胞株HepG2增殖，此對腫瘤診斷、基因治療有重要意義。

［1］Hanson RD，Hess JL，Yu BD，et al.Mammalian Trithorax and polycomb-group homologues are antagonistic regulators of homeotic development［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(25):14372-14377.

［2］Cheng GW，Ying JY，Jing Y，et al.EZH2 and STAT6 expression profiles are correlated with colorectal cancer stage and prognosis［J］.World J Gastroenterol，2010，16(19):2421-2427.

［3］Dimri，Manjari B，Prashant V，et al.Dietary omega-3 polyunsaturated fatty acids suppress expression of EZH2 in breast cancer cells［J］.Carcinogenesis，2010，31(3):489-495.

［4］陸海霞，危丹明，馮震博.EZH2在肝細胞癌中的表達及臨床意義［J］.解剖學報，2011，42(1):75-79.

［5］Kuner R，Votg M，Hoppe-seyler F，et al.Identification of cellular targets for the human papillomavirus E6 and E7 oncogenes by RNA interferece and transcriptome analyses［J］.J Mol Med，2007，85(11):1253-1262.

［6］Cao R，Wang L，Wang H，et al.Role of histone H3 lysine 27 methylation in Polycomb-group silencing［J］.Science，2002，298(5595):1039-1043.

［7］Cao Q，Yu J，Dhanasekaran SM，et al.Repression of E-cadherin by the polycomb group protein EZH2 in cancer［J］.Oncogene，2008，27(58):7274-7284.

［8］Sasaki M，Yamaguchi J，Itatsu K，et al.Over-expression of polycomb group protein EZH2 relates to decreased expression of p16 INK4a in cholangiocarcinogenesis in hepatolithiasis［J］.J Pathol，2008，215(2):175-183.

［9］張一兵，牛海濤，暢繼武.RNA干擾沉默EZH2基因對人膀胱癌EJ細胞增殖的影響［J］.第四軍醫大學學報，2008，29(13):1184-1187.

［10］蔡干慧，陳曉宇.siRNA靶向沉默PcG蛋白EZH2對人胃癌細胞株MKN45增殖和侵襲力的影響［J］.胃腸病學，2009，14(3):132-135.

［11］Friedman JM，Liang G，Liu CC，et al.The putative tumor suppressor microRNA-101 modμlates the cancer epigenome by repressing the polycomb group protein EZH2［J］.Cancer Res，2009，69(6):2623-2629.

［12］Bracken AP，Pasini D，Capra M，et al.EZH2 is downstream of the pRB-E2F pathway，essential for proliferation and amplified in cancer［J］.EMBO J，2003，22(20):5323-5335.