VEGF-C對淋巴管內(nèi)皮細胞生物學功能的影響

陳志紅，李雅紅，趙嬡嬡，張守亮，朱 偉

(1江蘇大學附屬人民醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江212002;2江蘇大學基礎(chǔ)醫(yī)學與醫(yī)學技術(shù)學院)

淋巴內(nèi)皮和淋巴管新生在胚胎發(fā)生、組織水腫、炎癥和腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，但因缺乏特異性分子標志物，淋巴管內(nèi)皮細胞的研究進展較慢。血管內(nèi)皮細胞生長因子-C(VEGF-C)作為淋巴管內(nèi)皮細胞的特異性生長因子，在淋巴管發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。國內(nèi)外關(guān)于VEGF-C對淋巴管影響的研究多集中于腫瘤組織中與腫瘤淋巴管的生成和腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系［1，2］，但體外VEGF-C對淋巴管內(nèi)皮細胞生物學功能的影響國內(nèi)鮮見報道。2011年1～8月，我們觀察了不同濃度VEGF-C對小兒包皮來源的淋巴管內(nèi)皮細胞管形成和遷移能力的影響，旨在為研究VEGF-C對淋巴管內(nèi)皮細胞的抗輻射損傷作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 外科手術(shù)切除的小兒包皮組織標本;細胞因子VEGF-C;膠原酶，中性蛋白酶，胰蛋白酶，PE-IgG抗體，PE-VEGFR-3抗體;6孔板，Transwell 24孔板(8μm孔徑)、細胞培養(yǎng)瓶。

1.2 細胞分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察 獲取包皮組織標本后用青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 mg/mL)處理30 min，PBS沖洗干凈后中性蛋白酶(2.4 U/mL)處理，4℃過夜。PBS洗滌標本，去除表皮后剪成0.5 mm ×0.5 mm ×0.5 mm 的小塊，37 ℃、5%CO2孵箱中膠原酶(0.1%)消化2 h。收集消化液至含PBS的離心管中，殘余組織用PBS反復(fù)沖洗，收集液體至離心管中，1 000 r/min，離心10 min，PBS再次洗滌，含20%FBS、10 ng/mL的VEGF-C高糖DMEM重懸后400目無菌濾網(wǎng)過濾后將細胞種至涂有膠原的培養(yǎng)瓶中。24 h后棄去上清后PBS輕吹未貼壁的細胞，洗滌后 20%FBS、10 ng/mL的VEGF-C高糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 觀察項目

1.3.1 細胞形態(tài) 待培養(yǎng)細胞達到80%融合后進行正常的消化傳代，傳代后降低FBS濃度至10%。倒置顯微鏡下觀察淋巴管內(nèi)皮細胞形態(tài)。

1.3.2 細胞 VEGFR-3表達 用0.25%胰蛋白酶消化淋巴管內(nèi)皮細胞，PBS洗滌3次，加入 PE標記的抗人單克隆抗體 VEGFR-3，對照管加入同量PE標記的鼠抗人IgG，冰上避光孵育30 min，PBS洗滌2次，1 000 r/min，離心5 min，重新制成細胞懸液，流式細胞儀檢測VEGFR-3表達。

1.3.3 細胞管形成能力 選取生長狀態(tài)良好的淋巴管內(nèi)皮細胞，用0.25%胰酶消化后制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度，以1×104/mL密度均勻接種于6孔板并分為四組，分別采用終質(zhì)量濃度為0、50、100、150 ng/mL的 VEGF-C完全營養(yǎng)液培養(yǎng)，每個濃度設(shè)2個復(fù)孔。每隔24 h倒置顯微鏡下觀察1次細胞生長狀況。

1.3.4 細胞遷移能力 取生長狀態(tài)良好的淋巴管內(nèi)皮細胞，用0.25%胰酶消化后制成單細胞懸液，無血清培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞最終密度為1×105/200μL。Transwell小室的上室中每孔加入200 μL細胞懸液，下室中加入500μL VEGF-C終質(zhì)量濃度分別為 0、50、100、150 ng/mL 的完全營養(yǎng)液，每個濃度設(shè)2個復(fù)孔，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)8 h。將上室取出，PBS淋洗，用棉球輕輕擦掉上層未穿過的細胞，4%多聚甲醛固定30 min，PBS淋洗待膜自然干燥后，結(jié)晶紫染色15 min。PBS淋洗后倒置顯微鏡下拍照;每個孔選取5個高倍鏡視野。

1.4 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，多個樣本均數(shù)間的比較行單向方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài) 倒置顯微鏡下見原代培養(yǎng)細胞多呈成纖維細胞形態(tài)，細胞生長能力良好，生長速度快，原代培養(yǎng)12 d達80%融合，傳代培養(yǎng)后細胞形態(tài)變小，有部分呈多邊形(圖1)。

圖1 小兒包皮來源細胞形態(tài)(100×)

2.2 VEGFR-3表達 流式細胞儀檢測示VEGFR-3陽性表達率為30.3%(圖2)。

圖2 小兒包皮來源淋巴管內(nèi)皮細胞表面標志物VEGFR-3表達

2.3 管形成能力 顯微鏡下可觀察到在50～100 ng/mL范圍內(nèi)，隨VEGF-C濃度升高，細胞數(shù)目增多，管形成數(shù)目增加。0～150 ng/mL VEGF-C作用后細胞管形成數(shù)分別為(3.5 ±0.85)、(8.7 ±2.50)、(13.4 ± 3.47)、(16.0 ± 4.27)個。除 100 ng/mL與150 ng/mL的VEGF-C質(zhì)量濃度作用無顯著性差異外(P=0.065)，其余各質(zhì)量濃度間比較均有顯著性差異(P均＜0.01)(圖3)。

2.4 遷移能力 Transwell小室細胞遷移試驗示隨VEGF-C質(zhì)量濃度的增加，遷移細胞數(shù)目增加，0～150 ng/mL VEGF-C作用后遷移細胞數(shù)分別為(206±28.81)、(349 ± 12.45)、(516 ± 20.74)、(668 ±21.68)個。任意兩質(zhì)量濃度之間比較均有顯著性差異(P 均 ＜0.01)，見圖4。

圖3 VEGF-C對淋巴管內(nèi)皮細胞管形成能力的影響

圖4 VEGF-C對淋巴管內(nèi)皮細胞遷移能力的影響

3 討論

淋巴管內(nèi)皮細胞的分離和培養(yǎng)國內(nèi)外已有報道，Hu等［3］成功應(yīng)用免疫磁珠從人包皮組織分離得到淋巴管內(nèi)皮細胞，并對其增殖和管形成能力進行了分析。You等［4］應(yīng)用酶消化結(jié)合貼壁培養(yǎng)的方法對舌淋巴管瘤來源的淋巴管內(nèi)皮細胞進行了研究。而小兒包皮在許多關(guān)于淋巴管內(nèi)皮研究中被作為淋巴管內(nèi)皮細胞的主要來源，本次實驗應(yīng)用酶消化結(jié)合貼壁培養(yǎng)的方法從小兒包皮組織中獲取了淋巴管內(nèi)皮細胞，流式細胞儀檢測結(jié)果顯示VEGFR-3陽性表達率為30.3%。

VEGF-C作為淋巴管內(nèi)皮細胞特異的增殖因子可與VEGFR-3特異性結(jié)合促進淋巴管內(nèi)皮細胞增殖［5］，并對淋巴管內(nèi)皮細胞生物學功能起重要作用;其具體機制是VEGF-C與其受體VEGFR-3結(jié)合后激活Ros/MAPK或JNK信號通路，誘導淋巴管內(nèi)皮細胞肌動蛋白重組，促進其增殖，而這種結(jié)合又可使RAFTK酪氨酸酶磷酸化活化細胞骨架蛋白Paxillin促進淋巴管內(nèi)皮細胞的遷移［6］。本研究結(jié)果顯示在50～100 ng/mL范圍內(nèi)，隨VEGF-C質(zhì)量濃度的增加，管形成能力和遷移能力均增強，表明VEGFC可促進細胞的管形成及遷移。

VEGF-C在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用，腫瘤細胞及基質(zhì)細胞可自分泌和旁分泌VEGF-C和VEGFD，而VEGF-C和VEGF-D可與淋巴管內(nèi)皮細胞上的相應(yīng)受體VEGFR-3結(jié)合。這種結(jié)合可使淋巴管內(nèi)皮細胞分泌趨化因子和促有絲分裂因子促進腫瘤細胞向淋巴管遷移，引起淋巴管轉(zhuǎn)移［7］。Avraham等［8］研究顯示，放射治療可通過TGF-beta1介導組織纖維化造成真皮淋巴管的減少并干擾淋巴內(nèi)皮功能，這是由于淋巴管的減少及其功能發(fā)生障礙而造成淋巴水腫。小鼠和豬體內(nèi)淋巴水腫模型研究結(jié)果顯示，VEGF-C可使水腫部位淋巴管生成增加，恢復(fù)淋巴引流，減輕水腫［9，10］。

綜上所述，VEGF-C在淋巴管生成方面起著重要作用;對于放射造成的淋巴管損傷，VEGF-C是否可作為一種保護因子尚有待進一步研究。

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