類胚體形成對P19細胞向心肌細胞分化的影響

尹 青，陳 煒，李 莉，謝丹丹，龔 淼

(河北醫科大學組織學與胚胎學教研室，石家莊050017)

P19細胞是一種具有胚胎干細胞特性的小鼠畸胎瘤細胞系，其在體外單層培養條件下多次傳代可保持干細胞特性，條件培養可分化為包括心肌細胞［1～3］在內的多種細胞。P19細胞向心肌細胞分化過程中細胞發育相關基因的表達及電生理學特征基本模擬了正常小鼠心肌發育過程［4］，且易于培養、轉染，是研究心肌細胞發育及相關基因轉錄調控的理想體外細胞系統。2010年5月～2011年2月，我們應用心肌細胞條件培養液培養P19細胞及P19細胞類胚體(EBs)并觀察了P19細胞的生長、分化狀態，旨在探討心肌環境因素及EBs形成對細胞分化的作用及心肌細胞的分化機制，為胚胎干細胞體外誘導分化機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 新生1～3 d的SD大鼠，雌雄不限(河北省實驗動物中心)。小鼠 P19細胞系(ATCC，CRL-1825，中國協和醫科大學細胞中心)。α-MEM培養基(美國Gibco公司)。心肌肌鈣蛋白T(cTnT)單克隆抗體(英國Abcam公司)，心肌細胞縫隙連接蛋白43(Connexin43，Cx43)單克隆抗體(美國 Invitrogen公司)。

1.2 P19細胞聚集培養 取復蘇傳代4代以上P19細胞，以0.25×106/mL密度接種于鋪有0.5%軟瓊脂［5］的96孔板中，于37℃、5%CO2培養箱中培養，每2 d半量換液，誘導4 d形成EBs或細胞聚集體。

1.3 心肌細胞分離培養及心肌細胞條件培養液制備 將新生SD大鼠心室組織剪成1 mm3大小的碎塊，加入3倍稀釋的0.25%胰酶與0.02%EDTA的混合液，37℃重復消化心肌組織，200目尼龍網過濾，收集濾液，1 000 r/min離心。取細胞沉淀制成單細胞懸液，差速貼壁法純化心肌細胞。將心肌細胞以4×105/mL密度接種于培養瓶中，每日收集培養液，離心，取上清液與α-MEM培養液1∶1混合，制備心肌細胞條件培養液。

1.4 P19細胞分化誘導 將P19細胞隨機分為四組，對照組將P19細胞以0.25×106/mL密度接種于鋪有蓋玻片的6孔板中，用α-MEM培養基培養;條件液培養組將P19細胞以0.25×106/mL密度接種于6孔板中，用心肌細胞條件培養液培養;EBs組將P19細胞EBs接種于6孔板中，用 α-MEM培養基培養。EBs+條件培養液組將P19細胞EBs接種于6孔板中，用心肌細胞條件培養液培養。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。

1.5 cTnT及Cx43表達檢測 ①免疫組化SP法:取各組培養7、10 d時的細胞，4%多聚甲醛固定后，按SP法進行免疫細胞化學染色［5］，觀察 cTnT表達。②Western blot法:收集各組培養7、10 d時細胞，提取總蛋白。定量后的蛋白各取80μg，PVDF膜轉移后用脫脂奶粉封閉。一抗分別為cTnT(1∶1 000)，Cx43(1∶400)，4 ℃過夜。ECL 試劑盒檢測免疫活性蛋白。以β-actin作為內參，用Image J軟件進行定量分析。

1.6 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。所有計量數據用ˉx±s表示，各組比較采用單因素方差分析或配對t檢驗，當方差分析有顯著性差異時進一步用q檢驗做兩兩比較。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 心肌細胞生長狀態 倒置相差顯微鏡下可見心肌細胞貼壁后細胞逐漸伸出突起，細胞核圓形，體積較大，培養2～3d后細胞伸出突起交織成網，細胞同步搏動，頻率多為60～120次/min。對照組與條件液培養組P19細胞貼壁生長，增殖速度較快，細胞大量堆積，出現接觸性死亡。EBs組與EBs+條件培養液組EBs黏附生長，EBs中央聚集細胞壞死，形成壞死區，細胞由EBs邊緣爬出，在EBs周圍形成生長暈，部分細胞體積增大，呈梭形或桿狀且彼此相連。各組均未觀察到跳動細胞。

2.2 cTnT及Cx43表達 免疫組化SP法檢測示對照組與條件液培養組未見cTnT陽性細胞。EBs組與EBs+條件培養液組在EBs周圍可見cTnT陽性細胞，EBs+條件培養液組陽性細胞數多于EBs組，散在或聚集分布于EBs周圍的生長暈中，隨培養時間延長，陽性細胞數有增多趨勢。Westernblot法檢測結果示對照組與條件液培養組未發現cTnT和Cx43表達。培養7、10d時EBs+條件培養液組cT-nT和Cx43表達均明顯高于EBs組(P均＜0.05，圖1，圖2)。EBs+條件培養液組cTnT和Cx43表達第10天時顯著高于第7天(P均＜0.01，圖1，圖2)。

3 討論

心肌細胞不可逆性壞死、功能性細胞數量下降等所致的心力衰竭是心血管疾病患者的主要死亡原因之一。近年來對干細胞的深入研究發現，干細胞移植治療可取代受損心肌細胞并重建血運。但干細胞向心肌細胞分化的機制尚不清楚，如何有效誘導干細胞向心肌細胞分化是亟待解決的問題。

圖1 兩組cTnT表達

圖2 兩組Cx43表達

P19細胞是從小鼠畸胎瘤中分離得到的具有胚胎干細胞特性的胚胎畸瘤細胞，與胚胎干細胞在分化潛能、超微結構及細胞表面抗原和生化特性等方面具有相似性，由于其在心肌細胞發育過程中與小鼠胚胎干細胞有相似的特性，故常被作為研究心肌細胞早期分化的模型系統［4］。以往的研究中多應用化學試劑(二甲基亞砜、視磺酸、5-氮胞苷等)誘導P19細胞的分化，但化學誘導劑具有一定毒性，限制了其應用。目前認為，心臟微環境對于干細胞的分化具有重要的誘導作用，但心臟環境較為復雜，具體何種因素影響干細胞向心肌細胞分化目前尚不清楚。

cTnT為細胞骨架蛋白，只在心肌細胞特異性表達;Cx43是心肌細胞間的主要連接蛋白，心肌細胞間電信號的傳導有賴于Cx43結構和功能的完整性，二者均是鑒定心肌細胞分化的常用指標。本研究結果顯示，P19細胞在心肌細胞條件培養液中單層培養條件下無cTnT、Cx43表達，表明單純的心肌細胞外環境不能刺激誘導P19細胞分化為心肌細胞。Rangappa 等［6～8］研究發現，條件培養或間接接觸共培養條件下培養骨髓間充質干細胞，未發現心肌細胞特異性基因表達。由此可見，心肌細胞、成纖維細胞等心臟組織細胞的分泌物不足以誘導干細胞向心肌細胞分化，或許與所選用細胞與細胞所處心肌細胞條件培養液的濃度、生長發育時間有關。

EBs作為胚胎干細胞誘導分化模型，在誘導細胞分化的研究中廣泛應用［9］。在胚胎發育和體外實驗中發現［10～12］，內臟內胚層細胞條件培養及直接接觸培養均可誘導ESCs向心肌細胞分化。中胚層向終末心肌細胞的分化過程中受到中胚層，特別是內胚層的信號誘導及基因調控。在細胞聚集體形成過程中心肌細胞早期轉錄因子GATA-4表達量增加，可促進干細胞向心肌細胞分化。我們的研究顯示，EBs在自然培養條件下，部分細胞表達心肌細胞特異cTnT，而單層培養P19細胞無心肌細胞分化，表明EBs或細胞聚集體的形成或許模擬了早期胚層形成過程，對于促進心肌細胞分化具有重要作用;而EBs形成結合心肌細胞條件培養液培養后心肌細胞cTnT及Cx43表達明顯高于EBs自然培養，表明心臟組織液可促進P19心肌細胞特異蛋白的表達，促進細胞分化。本實驗中均未觀察到跳動細胞，可能與細胞誘導時間及分化細胞的數量有關。

總之，EBs形成結合心肌細胞條件培養液培養可有效促進P19細胞向心肌細胞分化，具體分化機制有待進一步研究。而干細胞向心肌細胞分化是一極其復雜的過程，如何誘導分離大量的心肌細胞用于細胞移植治療仍需深入研究。

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