熒光定量PCR檢測(cè)痰結(jié)核分枝桿菌DNA的應(yīng)用價(jià)值

張東浩 李 影

（吉林省結(jié)核病醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 九臺(tái) 130500）

結(jié)核病是目前嚴(yán)重威脅人類健康的重大傳染性疾病之一[1]，但只要早期診斷和合理用藥，絕大多數(shù)的結(jié)核病患者是可以治愈的。結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種以呼吸系統(tǒng)為主的傳染病，主要由含菌的飛沫通過呼吸道傳播。因此，結(jié)核病患者痰液中常含有一定量的結(jié)核分枝桿菌，通過查痰可及時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)結(jié)核病的診斷、治療及預(yù)后均有重要意義。而細(xì)菌學(xué)檢查是發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌的主要途徑，主要有抗酸菌涂片染色、培養(yǎng)分離、熒光定量PCR等方法。現(xiàn)就熒光定量PCR法進(jìn)與另外兩種常規(guī)方法對(duì)結(jié)核病患者痰標(biāo)本進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)其在結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

2011年1月1日至2011年9月30日我院住院的肺結(jié)核患者，均為根據(jù)患者臨床癥狀、胸部影像學(xué)檢查、痰抗酸菌涂片染色、痰改良羅氏培養(yǎng)等確診的病例[2]，共計(jì)289例。其中男性153例，女性136例，年齡在15～86歲。

1.2 痰標(biāo)本收集

囑患者留取清晨第一口痰。在留痰之前先用清水漱口數(shù)次，以清除口腔內(nèi)的食物殘?jiān)安糠蛛s菌。留取的痰液應(yīng)是用力咳嗽后自氣管內(nèi)咳出的痰，約2～3mL，然后乘于一次性無(wú)菌塑料標(biāo)本盒中。不要將唾液或鼻涕吐入標(biāo)本盒，以免影響檢驗(yàn)結(jié)果。

1.3 試劑與儀器

抗酸菌涂片染色：試劑 按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第三版）（796）標(biāo)準(zhǔn)自行配置。無(wú)需特殊儀器。改良羅氏培養(yǎng)：試劑 羅氏培養(yǎng)基由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。4%NaOH由實(shí)驗(yàn)室自行配置。儀器 隔水式培養(yǎng)箱由天津市泰斯特儀器有限公司提供。熒光定量PCR：試劑 熒光定量PCR檢測(cè)試劑由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供。4%NaOH由實(shí)驗(yàn)室自行配置。儀器 LightCycler3.5全自動(dòng)熒光定量基因擴(kuò)增儀由羅氏公司提供。

1.4 方法

抗酸菌涂片染色：按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第三版）（795-796）標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行操作。改良羅氏培養(yǎng)：按照試劑配套說(shuō)明書進(jìn)行操作。熒光定量PCR：按照試劑配套說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

3種方法檢測(cè)痰中結(jié)核分枝桿菌的陽(yáng)性檢出率分別為抗酸菌涂片染色法28.37%（82/289），改良羅氏培養(yǎng)法48.10%（139/289），熒光定量PCR法72.66%（210/289）。見表1。

表13 種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌方法的陽(yáng)性率 （%）

3 討 論

我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病的患患者數(shù)在世界居第2位。現(xiàn)有肺結(jié)核患者約451萬(wàn)，其中痰涂片陽(yáng)性肺結(jié)核約150萬(wàn)人（結(jié)核病傳染源），全國(guó)每年新發(fā)肺結(jié)核患者約145萬(wàn)人，全年死于結(jié)核病者達(dá)12萬(wàn)余人，相當(dāng)于各種其他傳染病死亡人數(shù)總和的2倍[3]。因此，結(jié)核病的快速診斷依然是亟待解決的問題。

在眾多的輔助檢查中，細(xì)菌學(xué)檢查是結(jié)核病確診及發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段，因此結(jié)核病患者的痰液檢查，具有重要的意義。

首先，具有診斷和鑒別診斷的價(jià)值：結(jié)核病的診斷依據(jù)是綜合性的，單靠臨床表現(xiàn)和影像學(xué)特征而缺乏病原學(xué)的檢查易出現(xiàn)漏診和誤診，以致延誤病情。而所有診斷依據(jù)中，病原學(xué)的檢查是核心，是確立診斷最肯定的檢查項(xiàng)目。一旦痰液中找到結(jié)核桿菌，結(jié)核病的診斷即可成立。因此，這是肺結(jié)核與肺癌及其他肺部疾病鑒別的最有利的檢查手段。

其次，幫助選擇合理的化療藥物：特別對(duì)初治原發(fā)耐藥和復(fù)治繼發(fā)耐藥患者意義重大。根據(jù)查痰后的藥敏結(jié)果，可以針對(duì)性選擇有效的全身化療藥物，比盲目的經(jīng)驗(yàn)型選擇抗癆方案更科學(xué)、更合理，所取得的療效當(dāng)然更好。

最后，判斷療效的最重要指標(biāo)：結(jié)核病的療效判定亦是綜合性的，癥狀、體征、影像學(xué)檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查及其他輔助依據(jù)均為療效判斷指標(biāo)之一，而細(xì)菌學(xué)的檢查最重要，特別是對(duì)菌陽(yáng)患者，若菌陽(yáng)患者痰菌逐漸減少以至轉(zhuǎn)陰，提示病情好轉(zhuǎn)，治療有效，結(jié)核菌絕大部分已被殺滅。若痰菌持續(xù)陽(yáng)性，或菌陰患者一段時(shí)間后出現(xiàn)菌陽(yáng)，考慮病情進(jìn)展、惡化、治療無(wú)效，必要時(shí)需要更改方案。因此痰菌檢查可直觀地判斷療效，及時(shí)地明確目前病情。

痰涂片抗酸染色檢查是全世界結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室都在使用的最基本的細(xì)菌學(xué)檢查方法。其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速和廉價(jià)，1～2小時(shí)即可回報(bào)結(jié)果，對(duì)結(jié)核病早期診斷起著重要作用；缺點(diǎn)是無(wú)法辨別死菌與活菌。該法受實(shí)驗(yàn)室條件、檢驗(yàn)人員的涂片、染色、鏡檢技術(shù)水平的影響較大，且靈敏度低，通常需5000～10000條菌/毫升才能得到陽(yáng)性結(jié)果，且結(jié)核病患者常為間歇性排菌，可能造成假陰性結(jié)果。特意相差，而且各種抗酸桿菌均可找色，需進(jìn)一步試驗(yàn)才能確定是否為結(jié)核分枝桿菌。有些耐藥菌或經(jīng)化療后的結(jié)核病患者的痰排菌轉(zhuǎn)為L(zhǎng)型，對(duì)抗酸染色不敏感，難以查到，而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

改良羅氏培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度略高于涂片法，特異性好，并可鑒定死菌與活菌，還可以進(jìn)一步藥物敏感性的鑒定，被譽(yù)為結(jié)核病診斷的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”；缺點(diǎn)是用時(shí)太長(zhǎng)，通常需6～8周才能獲得結(jié)果，而且非結(jié)核分枝桿菌也可生長(zhǎng)，需進(jìn)行菌種鑒定方可確定是否為結(jié)核分枝桿菌。由于上述原因，致使結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢查一直不能滿足臨床診斷的需求[4]。

熒光定量PCR是一種密閉的擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)，所檢測(cè)的是結(jié)核分枝桿菌的特異DNA片段，具有敏感度、特異度高及方便快速、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果分析由計(jì)算機(jī)自動(dòng)完成，特別是對(duì)難以培養(yǎng)與生長(zhǎng)緩慢的結(jié)核桿菌的檢測(cè)更有優(yōu)勢(shì)[5]。陽(yáng)性下限僅為10個(gè)拷貝/毫升，操作簡(jiǎn)單，只需2～3h即可完成。實(shí)際操作中熒光定量PCR的定量結(jié)果，可以指導(dǎo)臨床用藥和療效評(píng)估。

綜上所述，熒光定量PCR方法檢測(cè)痰中結(jié)核分枝桿菌具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，結(jié)果真實(shí)可靠，可作為結(jié)核病的常規(guī)診斷方法，在臨床上有重要的應(yīng)用價(jià)值。

在實(shí)際應(yīng)用中，抗酸菌涂片法和熒光定量PCR法可為臨床及時(shí)提供診斷依據(jù)，培養(yǎng)及藥敏失言可指導(dǎo)臨床用藥，熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA濃度可用于判斷療效。因此，應(yīng)根據(jù)需要，合理選擇和組合檢測(cè)方法，方能更好的為臨床提供科學(xué)證據(jù)。

[1]衛(wèi)生部殷大奎副部長(zhǎng)在2001年“3.24”世杰防治結(jié)核病日專家座談會(huì)上的講話[J].中國(guó)防癆雜志,2001,23(4):207.

[2]肖東樓,趙明.中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南[S].2008:25-26.

[3]樊學(xué)軍,孫敏.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的比較研究[J].中國(guó)國(guó)境衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2005,28(1):160-162.

[4]張翊,盧建平,葉淼.四種結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].中國(guó)防癆雜志,2006,28(1):14-17.

[5]彭麗,羅永艾.結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室快速診斷[J].新醫(yī)學(xué),2005,36(1):359-361.