采用PCR法對(duì)乙型肝炎病毒基因型檢測(cè)的臨床觀察與分析

夏獻(xiàn)顆 郭佐華

（湘潭縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 湘潭 411228）

目前乙型肝炎病毒臨床基因分型為A～H共8個(gè)基因型，并且還可能同人類感染乙型肝炎病毒途徑、疾病進(jìn)展、藥物抗病毒治療效果存在一定關(guān)系，但是乙型肝炎病毒基因型還存在地區(qū)分布差異性，檢測(cè)方法也存在多樣，致使研究結(jié)論各有差異，本研究采用分型準(zhǔn)確率高、操作相對(duì)簡(jiǎn)單的基因型特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)法（以下簡(jiǎn)稱PCR法）對(duì)我院2010年6月至2011年5月收治的部分乙型肝炎病毒感染者血清實(shí)施了基因型檢測(cè)、分析，現(xiàn)將其報(bào)告如下。

1 資料與方法

從我院2010年6月至2011年5月收治的乙型肝炎病毒感染者中將存在甲、丙、戊等其他肝炎病毒感染及其他可引發(fā)肝臟病變疾病的患者排除，選取430例患者血清進(jìn)行乙型肝炎病毒基因型檢測(cè)、分析，其中男性372例，女性58例，年齡2至65歲，平均（33.2±14.85）歲，病程1～40年，平均（9.84±11.01）年。所有患者入院診斷均符合《病毒性肝炎防治方案》（2000年全國(guó)病毒性肝炎西安學(xué)術(shù)會(huì)議所制訂），其中乙型肝炎病毒攜帶者91例、慢性乙型肝炎206例、急性乙型肝炎10例、肝炎肝硬化110例、原發(fā)性肝癌13例。血清采集后在-70℃下保存。

1.2 儀器和試劑

采用美國(guó)Promega公司的核酸提取試劑盒，上海生工生物技術(shù)公司的Taq DNA和dNTP聚合酶，上海華美生物工程公司的HBeAg檢測(cè)試劑盒、瓊脂糖、phiX174 DNA/HaeⅢDNA分子量標(biāo)志物。德國(guó)臺(tái)式高速離心機(jī)、PCR凝膠成像儀、熱循環(huán)儀。

1.3 基因分型檢測(cè)

將待檢血清50μL加入60μL裂解液中并使其混勻，行10min 37℃水浴后，分別加入49∶1的氯仿/異戊醇和Tris飽和酚各30μL并充分混勻，再行10min的14000r/min離心，取上清液。將醋酸鈉溶液10μL和等體積異丙醇加入所取上清液中并在-20℃下沉淀2h，再行15min的14000r/min離心，將上清液棄去，加入500μL75%的預(yù)冷乙醇，再行10min的14000r/min離心，棄去上清液，在50℃下將沉淀干燥后，用DEPC水20μL溶解、20℃保存，作為PCR反應(yīng)模板。

采用巢式PCR和多對(duì)引物法采用40μL反應(yīng)體系實(shí)施兩輪擴(kuò)增，兩次擴(kuò)增反應(yīng)體系不同，其中第一次包括10×4μL緩沖液、4μLdNTP、2.4MgCl2、0.8μLPl、0.8μLS4R、10μLHBV DNA模板、0.2μLTaq酶、17.8μLH2O；第二次包括10×4μL緩沖液、4μLdNTP、2.4MgCl2、0.8μLB2、0.8μLBA1R、0.8μLBB1R、0.8μLBC1R或者0.8μLB2R、0.8μLBD1、0.8μLBE1、0.8μLBF1、5μL第一輪產(chǎn)物、0.4μLTaq酶、21μLH2O。

第一次擴(kuò)增反應(yīng)在10min的95℃預(yù)變后20s94℃、20s55℃、1min72℃的40個(gè)循環(huán)，然后行10min72℃延伸，取第一輪產(chǎn)物，作為第二輪擴(kuò)增模板。第二次反應(yīng)是10min的95℃預(yù)變后20s94℃、20s65℃、30s72℃的40個(gè)循環(huán)，然后行7min72℃延伸，得第二輪產(chǎn)物。

取第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物10μL，用瓊脂糖凝膠20g/L將其在100V電壓下電脈20min，然后采用凝膠成像儀對(duì)生成的電脈條帶大小進(jìn)行觀察，以確定基因分型，其中68bp為A型、281bp為B型、122bp為C型、119bp為D型、167bp為E型、97bp為F型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS12.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。

2 結(jié) 果

2.1 基因型分型結(jié)果

依據(jù)電泳帶確定乙型肝炎病毒基因型（見(jiàn)圖），430例血清中B基因型262例，占60.93%；C基因型51例，占11.86%；BC基因型117例占27.21%；未檢測(cè)到其他基因型的存在。見(jiàn)圖1。

2.2 基因型分布狀況

各類乙型肝炎病毒感染中，B基因型在病毒攜帶者以及急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、原發(fā)性肝癌患者中分布占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，C基因型在各類乙型肝炎病毒感染的分布不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上差異（P＞0.05），BC基因型多見(jiàn)于肝炎肝硬化患者，差異具有顯著性（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表2 各基因型臨床特征

圖1 基因型分型結(jié)果

表1 乙型肝炎病毒基因型在各類型感染中的分布（n，%）

2.3 各基因型臨床特征

本研究中430例感染患者中，各基因型于不同年齡不存在明顯相關(guān)性，同性別中分布不具有顯著性差異（P＞0.05）；BC基因型血清ALT水平較高，但不存在顯著性差異（P＞0.05）；不同基因型患者血清內(nèi)乙型肝炎病毒基因含量差異不具有顯著性（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

3 討 論

感染病毒基因類別與疾病進(jìn)展及感染譜可能存在一定的關(guān)聯(lián)性，會(huì)對(duì)疾病轉(zhuǎn)歸造成一定影響，乙型肝炎病毒基因型的研究以及準(zhǔn)確分型對(duì)乙型肝炎的治療、病情進(jìn)展以及預(yù)后評(píng)價(jià)具有一定的價(jià)值[1]。

3.1 乙型肝炎病毒基因型分布

乙型肝炎病毒基因型具有明顯的地理性差異，是乙型肝炎病毒進(jìn)化的體現(xiàn)，表現(xiàn)出乙型肝炎病毒自然感染史在世界各地的變異特點(diǎn)，其中A型主要分布在西歐、北歐、印度、非洲中部及美國(guó)；B、C型主要分布在太平洋地區(qū)及亞洲東、南部國(guó)家，如中國(guó)、印度尼西亞、越南、日本等；E型則僅限于非洲地區(qū)；F型主要分布在美洲中、南部的土著以及美國(guó)、波利尼西亞等地；G型主要分布在法國(guó)、美國(guó)、墨西哥、德國(guó)；H型是從F型轉(zhuǎn)化出來(lái)的，目前主要美國(guó)中部的印第安人中[2]，墨西哥、尼加拉瓜等地也有發(fā)現(xiàn)。

我國(guó)主要的乙型肝炎病毒基因型B、C基因型在國(guó)內(nèi)分布也具有地理區(qū)域性特征，從南到北，B型逐漸增多、C型則呈減少趨勢(shì)，另外部分地區(qū)如廣東、寧夏、香港存在D型感染，罕見(jiàn)A型[3]，其他E、F、G、H基因型目前還未在國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)。本研究中采用基因型特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)法對(duì)430例乙型肝炎病毒感染者血清進(jìn)行了病毒基因型檢測(cè)，430例血清中B基因型262例，占60.93%；C基因型51例，占11.86%；BC基因型117例占27.21%；未檢測(cè)到其他基因型，結(jié)果與國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道基本一致。

3.2 乙型肝炎病毒感染基因型臨床觀察

乙型肝炎病毒感染基因型與患者感染類型、肝功能的關(guān)系，目前還未有明確定論，本研究中各類乙型肝炎病毒感染中，B基因型在病毒攜帶者以及急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、原發(fā)性肝癌患者中分布占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，C基因型分布不具顯著差異（P＞0.05），BC基因型多見(jiàn)于肝炎肝硬化患者，差異具有顯著性（P＜0.05），BC基因型血清ALT水平較高，但不存在顯著性差異（P＞0.05），顯示BC基因型與疾病進(jìn)展可能存在一定關(guān)聯(lián)性；而各基因型于不同基因型患者血清內(nèi)乙型肝炎病毒基因含量差異不具有顯著性（P＞0.05），提示肝臟病毒復(fù)制和炎癥與病毒基因型可能不存在相關(guān)性。

[1]李彩東,吳斌,田鵬飛,等.某地區(qū)乙型肝炎病毒基因型檢測(cè)及其與患者肝功能的關(guān)系分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011,32(13):1490-1492.

[2]劉興,唐紅,何芳.乙型肝炎病毒基因型研究新進(jìn)展[J].世界華人消化雜志,2006,14(22):2211-2216.

[3]吳贊,孫余婕.乙型肝炎病毒基因型的國(guó)內(nèi)研究進(jìn)展[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2010,31(7):703-704.