黃芪多糖活化AMPK減輕游離脂肪酸對C2C12成肌細胞的細胞毒性*

宋 杰，李 靜，胡陽黔，劉 堅，歐陽靜萍△

(1湖北醫藥學院附屬東風醫院，2湖北醫藥學院，湖北 十堰 442000;3武漢大學醫學院，湖北 武漢 430079)

2型糖尿病(diabetes mellitus，DM)和肥胖患者中存在脂代謝紊亂，甘油三酯、游離脂肪酸(free fatty acids，FFAs)和膽固醇均有升高。2001年美國糖尿病學會(ADA)年會上McGarry教授提出脂代謝障礙為DM及其并發癥的原發病理生理改變，同時提出可將2型DM稱作“糖脂病”，因此脂毒性理論越來越受到重視。脂毒性是指增高的循環游離脂肪酸濃度或增高的細胞內脂質含量的致糖尿病作用，骨骼肌是其主要作用部位之一［1］。本實驗室毛先晴等［2］的研究中表明，黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)“APS治療可明顯改善高脂飲食誘導的胰島素抵抗，而骨骼肌是胰島素抵抗發生的重要部位。本研究旨在FFAs對骨骼肌細胞的毒性以及應用中藥黃芪主要活性成分APS進行干預治療，探討APS對FFAs毒性的減輕作用及其可能機制。

材料和方法

1 主要試劑和儀器

C2C12成肌細胞(ATCC，批號 CRL－1771TM);低糖DMEM購自Sigma;胎牛血清購自Hyclone;優化水煎工藝從膜莢黃芪(上海藥材公司)中提取APS(80～120 kD)(湖北中醫學院藥用植物鑒定教研室鑒定)，臨用前生理鹽水配成12%水溶液供實驗用［3］;MTT購自 Sigma;AMP活化蛋白激酶(AMP－activated protein kinase，AMPK)抗體購自Cell Sigaling Technology;磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK，p－AMPK)抗體和磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(phosphorylated acetyl－CoA carboxylase，p－ACC)抗體均購自Upstate;BCA Protein Assay Kit購自Pierce;蛋白內參照采用 β－actin，購自Abcam;Protein Detector Western blotting Kit LumiGLO System購自KPL;5－氨基咪唑－4－甲酰胺－1－β－D－呋喃核糖苷(5－aminoimidazole－4－carboxamide－1－β－D－ribofuranoside，AICAR)購自Toronto Research Chemicals;長鏈游離脂肪酸(2/1 oleate/palmitate)購自Sigma，在37℃水浴中用少量無水乙醇溶解后加入已過濾除菌的5%(質量分數)牛血清白蛋白(第Ⅴ組分，不含游離脂肪酸)溶液，充分混勻后加入低糖DMEM培養液中，長鏈脂肪酸終濃度為0.25 mmol/L，其中油酸和軟脂酸的質量比為2∶1，無水乙醇終濃度為0.5%(體積分數)。

2 細胞傳代和培養

采用小鼠成肌細胞C2C12，用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的低糖DMEM培養液，在5%CO2、37℃培養箱培養。

3 實驗分組

取對數生長期的細胞，倒出培養液，用無菌PBS沖洗3次，0.25%胰酶消化，然后計數每個培養瓶的細胞密度，以1×109/L轉入新的培養瓶，并如下分組:(1)對照組;(2)APS組;(3)AICAR組，AICAR為AMPK的特異性激動劑，此組作為AMPK活化的陽性對照組;(4)FFAs+APS組，經FFAs(0.25 mmol/L)［4－5］處理 24 h 后換成 APS(200 mg/L)作用 24 h;(5)FFAs組，經 FFAs(0.25 mmol/L)處理 24 h 后換成生理鹽水(normal saline，NS)作用24 h(以與FFAs+APS對照)。

4 方法

4.1 MTT實驗 (1)取生長良好的細胞，以2×107/L細胞懸液接種于96孔培養板中，每個實驗組種8孔，每孔接種100 μL，培養12 h細胞貼壁后，吸棄培養液，按實驗分組加入相應培養液100 μL繼續培養。(2)在24 h時點的前4 h各取培養板1塊，每孔加入5 mg/L MTT 50 μL，繼續培養4 h后，吸棄上清液后向每孔加入20%DMSO 100μL，振蕩后在酶標儀上以490 nm波長測吸光度A值。

4.2 Werstern bloting檢測 將處理后的細胞，用PBS沖洗，冰上充分裂解后，置4℃超速離心機，離心，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒定量。煮沸5 min，SDS－PAGE分離蛋白后，轉印到PVDF膜上，5%牛血清白蛋白封閉2 h，漂洗后加入Ⅰ抗于4℃孵育過夜，漂洗后再加入辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔Ⅱ抗(1∶800稀釋，KPL)室溫孵育1 h，漂洗后ECL顯色，用高清晰度彩色病理細胞測量程序的圖形分析軟件系統測出相對吸光度值。

4.3 AMP/ATP比值測定 取上述分組細胞倒出培養液，用無菌PBS沖洗3次，用0.25%胰酶消化，用無藥物培養基吹打細胞，將細胞懸液1500 r/min離心10 min，棄去上清液再用PBS混懸漂洗2次，然后用0.5 mL蒸餾水將細胞沉淀混懸，移入1.0 mL勻漿器內，勻漿5 min，勻漿液移入1.5 mL離心管中，5000 r/min離心10 min，取上清液200 μL置于 －80℃待高效液相色譜法分析。色譜條件:Dikma公司ODS－3反相柱(250×4.6 mm)，流動相為50 mmol/L磷酸鉀緩沖液，調 pH至6.5，等比洗脫，流速1.2 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫20℃，進樣量20 μL。

4.4 透射電鏡 C2C12細胞分對照組、FFAs組和FFAs+APS組，FFAs處理24 h分別換成NS和APS繼續處理24 h，消化貼壁完好的C2C12細胞，用PBS洗2遍(離心、吹打，離心管內完成)。然后轉入1.5 mL EP管內，用電鏡專用的戊二醛固定2.5 h。經脫水、浸潤、包埋、切片后電鏡觀察。

5 統計學處理

結 果

1 APS與FFAs對C2C12細胞存活率的影響

APS處理24 h后，FFAs+APS組細胞存活率明顯高于FFAs組(P＜0.01)，見表1。

2 透射電鏡觀察

APS(200 mg/L)作用24 h，可顯著減輕FFAs導致的線粒體腫脹、嵴消失、空泡化等損傷，見圖1。

表1 APS干預對FFAs損傷C2C12細胞活性的影響Table 1.The effects of APS and FFAs on viability of C2C12 cells(A..n=8)

表1 APS干預對FFAs損傷C2C12細胞活性的影響Table 1.The effects of APS and FFAs on viability of C2C12 cells(A..n=8)

FFAs+APS:C2C12 cells were treated by FFAs for 24 h，and then treated by APS for another 24 h instead.＊＊P ＜0.01 vs control group;△P ＜0.05 vs FFAs group(24 h，48 h).

Group 0 h 24 h 48 h Control 0.832 ±0.015 0.821 ±0.024 0.805 ±0.044 APS 0.821 ±0.077 0.833 ±0.019 0.798 ±0.053 FFAs 0.825 ±0.077 0.414 ±0.040＊＊ 0.223 ±0.041 FFAs+APS 0.845 ±0.069 0.430 ±0.029＊＊ 0.701 ±0.050△AICAR 0.829 ±0.015 0.817 ±0.042 0.799 ±0.035

Figure 1.The C2C12 cell ultrastructure(×17000).A:control group;B:FFAs group;C:FFAs+APS group;D:AICAR group;E:APS group.FFAs:free fatty acids;APS:Astragalus polysaccharide;AICAR:5－aminoimidazole－4－carboxamide－1－β－D－ ribofuranoside.Arrows:vacuolar degeneration of mitochondria.圖1 C2C12細胞電鏡圖

3 AMPK、p－AMPK和p－ACC的表達

圖2顯示，總AMPK表達各組間無顯著差異(P＞0.05);FFAs組p－AMPK及p－ACC表達較對照組顯著降低(P＜0.01);而FFAs+APS組p－AMPK較FFAs組顯著增加(P＜0.01)，p－ACC表達較FFAs組顯著增加(P＜0.05)。

Figure 2.The expression of acetyl－CoA carboxylase(ACC)，phosphorylated ACC(p－ACC)，AMP－activated protein kinase(AMPK)and phosphorylated AMPK(p－AMPK)proteins..n=4.▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs control group;*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs FFAs group.圖2 乙酰輔酶A羧化酶、磷酸化乙酰輔酶A羧化酶、腺苷酸活化蛋白激酶和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶蛋白的表達

4 C2C12細胞內AMP/ATP比值測定

表2顯示，與 FFAs組比較，FFAs+APS組C2C12細胞經APS作用24 h后AMP/ATP比值顯著增大(P＜0.01)。

表2 APS干預對FFAs損傷C2C12細胞AMP/ATP比值的影響Table 2.The effects of APS and FFAs on AMP/ATP ratio of C2C12 cells(.n=8)

表2 APS干預對FFAs損傷C2C12細胞AMP/ATP比值的影響Table 2.The effects of APS and FFAs on AMP/ATP ratio of C2C12 cells(.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs FFAs group.

Control APS FFAs FFAs+APS AICAR ATP(μmol/L)1.08±0.08 0.99±0.03 0.98±0.08 0.69±0.03 0.89±0.12 AMP(μmol/L)0.42±0.01 0.38±0.12 0.09±0.01 0.26±0.12 0.11±0.03 AMP/ATP 0.43±0.07 0.39±0.01 0.08±0.030.40 ±0.13＊＊0.07 ±0.02

討 論

胰島素抵抗是多種疾病發生的共同基礎，特別是肥胖、2型糖尿病、高血脂和高血壓等代謝綜合征［4］。我們在前期研究中發現，無論是對STZ誘導的2型糖尿病動物模型，還是遺傳性2型糖尿病模型(KKAy小鼠)或胰島素抵抗模型，APS都具有增加胰島素敏感性、改善糖耐量，降低血糖和血脂、減少肝臟脂肪沉積以及減輕體重等作用［6－8］。

在本研究中，MTT實驗發現APS可以顯著提高經高FFAs處理后的細胞的活性。由此證實，APS可以減輕高游離脂肪酸對骨骼肌細胞的毒性。

為進一步研究APS減輕FFAs細胞毒性的機制，我們通過電鏡觀察發現，APS可一定程度修復FFAs損傷小鼠成肌細胞C2C12線粒體。該結論與岳曉莉等［9］研究中提出的“黃芪多糖能夠抑制線粒體膜電位崩解、保護線粒體形態”結論相似。

線粒體與能量代謝密切相關而AMPK是能量代謝的總開關。胰島素抵抗狀態下AMPK活性被抑制，AMPK的活化可以改善胰島素抵抗，降低甘油三酯和 FFAs含量，減輕脂毒性［10－11］。本實驗發現APS可以顯著增加 FFAs損傷 C2C12細胞中 p－AMPK(AMPK活化狀態)表達及 p－ACC表達。ACC為脂肪酸氧化中的關鍵酶，p－ACC為ACC失活狀態，p－ACC增加可促進細胞脂肪酸氧化。這表明APS可以通過活化AMPK進而使ACC失活，促進細胞內脂肪酸分解，減少脂肪酸蓄積，減輕高游離脂肪酸對細胞的毒性作用。

為進一步明確APS活化AMPK的機制，我們測定了AMP/ATP比值:與干預前相比，APS可以在干預24 h后增加細胞內AMP/ATP比值。AMP/ATP比值增加，可以促進AMPK活化［12］。這可能與APS修復損傷線粒體有關。

綜上所述，APS可以減輕FFAs對骨骼肌細胞的毒性。本研究為APS成為減輕FFAs毒性、改善胰島素抵抗的藥物提供了理論基礎。

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