小鼠早期完整胚胎誘導子宮內膜白血病抑制因子和整合素β3表達并提高子宮容受性*

李婷婷， 方 叢， 賈 磊， 岳超敏

(中山大學附屬第六醫院生殖醫學研究中心，廣東 廣州 510655)

1000-4718(2012)02-0193-08

2011-08-17

2011-12-14

國家自然科學基金資助項目(No.81070495)；廣東省自然科學基金資助項目(No.9151018201000018)

△通訊作者 Tel:020-38048013；E-mail:qingqingwenyuan@126.com

·論著·

小鼠早期完整胚胎誘導子宮內膜白血病抑制因子和整合素β3表達并提高子宮容受性*

李婷婷， 方 叢△， 賈 磊， 岳超敏

(中山大學附屬第六醫院生殖醫學研究中心，廣東 廣州 510655)

目的探討小鼠早期胚胎誘導子宮內膜容受性改變的空間結構，確定胚胎各個部分能否引起子宮內膜容受性中白血病抑制因子(LIF)和整合素β3改變。方法選用6～8周昆明雌鼠，體外實驗分為子宮內膜培養前組、子宮內膜單純培養組、子宮內膜全胚胎共培養組、子宮內膜卵裂球共培養組、子宮內膜透明帶共培養組，各組培養2 d后收集子宮內膜行下一步檢測；體內實驗分為胚胎移植前組、單純培養液移植組、全胚胎移植組、卵裂球移植組、透明帶移植組及正常妊娠未干預組，移植后2 d收集子宮內膜行下一步檢測。熒光定量PCR檢測整合素β3和LIF mRNA表達；免疫組織化學及Western blotting檢測整合素β3和LIF的蛋白表達部位及表達水平。結果體外實驗子宮內膜全胚胎共培養組中子宮內膜的整合素β3和LIF表達顯著高于其它組，體內實驗正常妊娠未干預組的整合素β3和LIF表達顯著高于其它組。結論完整胚胎可顯著提升小鼠孕早期子宮內膜容受性因子整合素β3和LIF的表達，而單純透明帶或卵裂球則不能明顯增加整合素β3和LIF的表達。早期胚胎誘導子宮內膜容受性可能需要完整胚胎結構的存在。

胚胎； 整合素β3； 白血病抑制因子； 子宮內膜容受性

自1978 年世界首例試管嬰兒在英國誕生以來，在30多年來，人類輔助生殖技術取得了突飛猛進的發展，有各種理念的革新和技術進步，然而目前輔助生殖技術的成功率仍不能達到人們期望值，部分患者反復多次體外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embyro transfer,IVF-ET)仍不能成功妊娠。胚胎植入是一個極其復雜的過程，需要正常發育胚胎和有良好容受性子宮內膜的共同作用，以及二者同步發育和分子水平的對話[1]，胚胎種植受多方面因素控制，包括胚胎質量、子宮內膜容受性、胚胎移植技術等[1]，其中因子宮內膜容受性差而致的胚胎種植失敗占失敗因素的60%[2]。國外學者研究發現患者子宮內膜上皮與植入前胚胎共培養可促使胚胎正常發育并提高胚胎與子宮內膜上皮間分子層面對話，從而提高IVF-ET成功率[3-4]，此技術對反復IVF-ET失敗的助孕患者尤其有宜[3,5]，并且Wakuda等[6]小鼠體內實驗推測胚胎亦能誘導子宮內膜容受性增加。綜上，提高妊娠率的關鍵在于如何提高子宮內膜容受性。目前認為子宮內膜容受性生物標志有細胞因子、黏附分子、生長因子、脂類等[2]，其中最具代表因子有白血病抑制因子(leukaemia-inhibitory factor,LIF)和整合素β3。雖證實早期胚胎與著床期子宮內膜共培養可提高子宮內膜容受性，從而提升妊娠率，但其具體機制尚未明朗，并且亦不清楚具體是胚胎哪一部分發揮了主要作用。本研究旨在通過體內外實驗探討胚胎的各部分包括透明帶、卵裂球及完整胚胎在誘導子宮內膜容受性中的作用，以期為臨床所用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 清潔級昆明小鼠，6～8周，體重25～35g，由中山大學動物中心提供，實驗動物合格證號為0083643。

1.2主要儀器和試劑 孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotrophin,PMSG) 和人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,HCG) (寧波激素制品廠)；掃描電鏡系統(Quanta200)、解剖鏡及倒置顯微鏡 (Nikon)、 二氧化碳孵箱 (Thermo Forma)、Mini-Protein電泳系統(Bio-Rad)、ABI 3900臺式高通量DNA合成儀(ABI)，ABI 7500全自動熒光定量PCR儀(ABI)、RNA提取試劑盒(Bio-Rad)、RT-PCR 試劑盒(Toyobo)、熒光定量PCR試劑盒(Toyobo)；DMEM/F12 (1∶1)培養基(Sigma)、M2培養基(Sigma)、FBS (Gibco) 、雌二醇(estradiol,E2) 及孕激素(progestogen,P4) (Sigma) 、胰島素 (Sigma) 、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)(Promega) 、acidic Tyrode’s solution (Sigma)；PVDF膜(Millipore)、整合素β3Ⅰ抗、LIF Ⅰ抗、β-actin、Ⅱ抗(Santa Cruz)；其它試劑除國產分析純主要購自Sigma。

2方法

2.1小鼠促排卵 制備輸精管結扎公鼠；小鼠腹腔注射孕馬血清促性腺激素10 U，46～48 h后注射人絨毛膜促性腺激素10 U，造成超排卵，然后雌雄按2∶1合籠，次晨檢查陰拴，發現陰栓為妊娠第1 d；一部分與正常公鼠合籠以獲得2細胞胚胎，一部分與絕育公鼠合籠以獲得假孕和代孕母鼠。

2.2小鼠子宮內膜和胚胎獲取及共培養 母鼠與正常公鼠合籠見栓后第2 d上午在無菌條件下迅速取出小鼠輸卵管，收集2細胞期胚胎，對胚胎進行相應處理，利用acidic Tyrode’s solution消化透明帶獲無透明帶卵裂球，顯微機械操作吸出卵裂球獲空透明帶，無菌條件下取出子宮內膜，擠壓法[7]獲得子宮內膜，剪成2 mm左右的小段，即隨即分為以下5組：(1)第2 d的子宮內膜；(2)單獨子宮內膜；(3)完整胚胎+子宮內膜；(4)無透明帶卵裂球+子宮內膜；(5)空透明帶+子宮內膜，每組10例標本。子宮內膜與胚胎各部分共培養：共培養條件類似譚冬梅等[8]的研究，并在此基礎上進行了改善，將子宮內膜、胚胎處理后隨機共培養于約30 μL微滴的培養液中[DMEM/F12 (1∶1) + 200 mL/L FBS，添加 17.5 nmol/L胰島素、63.5 nmol/L P4、7.14 nmol/L E2、20 μg/L EGF]，在 37 ℃、飽和濕度、5%CO2濃度培養箱內，每天觀察胚胎發育，2 d后取出子宮內膜行熒光定量PCR、免疫組織化學、Western blotting和掃描電鏡檢測，每組10例標本。

2.3體內移植 正常妊娠小鼠第2 d上午在無菌條件下迅速取出輸卵管，收集2細胞期胚胎，對胚胎進行相應處理，利用acidic Tyrode’s solution消化透明帶，獲無透明帶卵裂球，顯微機械操作吸出卵裂球獲空透明帶，分別移植入代孕母鼠輸卵管子宮連接部內，隨機分為以下6組：(1)假孕母鼠第2 d子宮；(2)移植5 μL培養液；(3)移植完整胚胎；(4)移植無透明帶卵裂球；(5)移植空透明帶；(6)與正常公鼠合籠后正常妊娠，每只代孕母鼠每側宮角移植3枚胚胎或每側移植5 μL培養液，每組10例標本。于孕第4 d取子宮組織行熒光定量PCR、免疫組織化學、Western blotting和掃描電鏡檢測。

2.4子宮內膜容受性檢測 子宮內膜組織一部分直接置入10%甲醛液中，行免疫組織化學檢測容受性標志物LIF和整合素β3的表達量；一部分置入電鏡標本前固定液(2.5%戊二醛+2%多聚甲醛+0.1 mol/L PBS)中，行掃描電鏡檢測容受性標志物胞飲突；一部分置于-80℃，待行熒光定量PCR和Western blotting檢測LIF和整合素β3的表達量。

2.4.1掃描電鏡 子宮內膜離體后立即用PBS沖洗干凈，置于前固定液，4 ℃冰箱中固定4 h后，50%、70%、80%、90%、100%乙醇脫水；100%丙酮15 min；醋酸戊異酯過渡液過夜，臨界點干燥后離子濺射鍍膜，貼板上機觀察胞飲突的形成及發育情況。

2.4.2免疫組化 子宮內膜標本經10%甲醛固定，常規石蠟包埋切片，切片烘干后梯度乙醇脫蠟，EDTA抗原修復，山羊血清(SP9001試劑A)封閉，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，滴加生物素標記山羊抗兔IgG(SP9001試劑B)，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(SP9001試劑C)，DAB顯色，蘇木素復染。每張切片隨機選取5個高倍視野(×400)， Image-Pro Plus 6.0分析著色區域積分吸光度值。陽性對照取生殖內分泌正常的30歲婦女黃體生成素(luteinizing hormone,LH)峰后7 d子宮內膜的切片，陰性對照以PBS代替Ⅰ抗。每組實驗均設置陽性及陰性對照。

2.4.3實時熒光定量PCR 采用總RNA提取試劑盒(Bio-Rad)提取總RNA(參照試劑盒說明提取)，逆轉錄試劑盒(Bio-Rad)進行逆轉錄；SYBR Green 熒光定量 PCR 試劑盒(Bio-Rad) 在 ABI7300 上進行整合素β3和LIF mRNA 定量分析，引物和實驗條件具體見表1，以 GAPDH為內參照基因，檢測重復3次。

表1 定量分析引物與主要參數

2.4.4Western blotting 總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA法(Merck) 檢測蛋白濃度；7.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE) 凝膠電泳；80 V、2 h，轉膜2 h；5%脫脂牛奶封閉液封閉1 h；Ⅰ抗4 ℃過夜；Ⅱ抗室溫孵育1 h；TBS 液清洗；ECL化學發光，X光片顯影定影；并用 ImageJ軟件計算各條帶的積分吸光度值。

3統計學處理

結 果

1子宮內膜組織形態學

所有標本均采用HE染色鑒定子宮內膜及完整性，體內實驗組子宮結構完整，子宮內膜腺體和上皮細胞結構清晰完整；體外實驗通過擠壓法獲得的子宮內膜結構完整，腺體和上皮細胞清晰可見，經過體外培養2 d后組織結構變得松散，但整體仍完整，見圖1。

Figure 1. The HE staining of endometrium. A: HE staining of uterus(×100); B: HE staining of endometrium obtained by squeezing method(×100); C: HE staining of endometrium culturedinvitrofor 2 d(×200).

圖1子宮內膜蘇木素-伊紅染色

2子宮內膜容受性形態

隨機選取各組標本，掃描電鏡觀察形態學變化，種植窗時期(交配后3.5 d)均有胞飲突的出現，交配后1.5 d(1.5dpc)胞飲突基本仍未發育，見圖2。表明所選檢測時間為種植窗時期，同時證明子宮內膜在體外培養仍能類似于體內繼續發生形態學和功能學變化。

Figure 2. Scanning electron microscopy (SEM) photomicrographs of endometrium. A: endometrium obtained by squeezing method(×100)；B: endometrium cocultured with embryoinvitrofor 2 d(×3 000)；C: endometrium of 1.5dpc(×3 000).

圖2子宮內膜掃描電鏡

3免疫組織化學結果

體內實驗各組小鼠子宮上皮細胞和腺細胞在見栓后第4 d均有整合素β3和LIF表達，以正常見栓無干預組表達顯著高于其余5組，差異有統計學意義(P<0.05)，其余5組組間整合素β3和LIF表達無顯著差異。體外實驗發現全胚胎子宮內膜共培養組中子宮上皮細胞和腺細胞在體外培養2 d后整合素β3和LIF表達顯著高于其余4組，差異有統計學意義(P<0.05)，其余4組組間整合素β3和LIF表達無顯著差異，見圖3。

4熒光定量PCR結果

體內實驗各組小鼠在見栓后第4 d均有整合素β3和LIF mRNA表達，以正常見栓無干預組表達顯著高于其余5組，有統計學意義(P<0.05)，其余5組組間整合素β3和LIF表達無顯著差異。體外實驗發現全胚胎子宮內膜共培養組中在體外培養2 d后整合素β3和LIF表達顯著高于其余4組，差異有統計學意義(P<0.05)，其余4組組間整合素β3和LIF表達無顯著差異，見圖4。

5Westernblotting結果

體內實驗中各組小鼠在見栓后第4 d均有整合素β3和LIF的表達，以正常見栓無干預組表達顯著高于其余5組，差異有統計學意義(P<0.05)，其余5組組間整合素β3和LIF表達無顯著差異。體外實驗發現全胚胎子宮內膜共培養組中在體外培養2 d后整合素β3和LIF表達顯著高于其余4組，差異有統計學意義(P<0.05)，其余4組組間整合素β3和LIF表達無顯著差異，見圖5。

討 論

胚胎植入是一個復雜的過程，需要發育良好的胚胎和具有容受性的子宮內膜，以及二者之間的同步發育和分子對話[1]。目前對于子宮內膜容受性的研究多是集中在對一些容受性標志因子的發現和檢測上，現已知的子宮內膜容受性標志分子有細胞因子、黏附分子、生長因子、脂類等[2]，Nikas等[9-10]認為胞飲突的出現是子宮內膜容受性狀態的形態學標志，根據胞飲突在時間和形態上的特征性，通過觀察胞飲突，可以更精確地確定植入窗開始和持續的時間，協助判斷子宮內膜接受性，具有準確、直觀和相對方便的優點，對于輔助生殖技術具有重要的指導意義[10]。在這項實驗中1.5dpc時掃描電鏡結果顯示基本無胞飲突的發育，說明種植窗還未開啟，孕4 d和共培養2 d后的子宮內膜胞飲突發育，種植窗開啟，該變化符合實驗的預測時間。觀察胞飲突的出現說明因子檢測是在胚胎種植窗，避免了時間選擇的錯誤。胚胎與子宮內膜存在“分子對話”機制，其參與的分子與子宮內膜容受性相關標志物基本一致。對胚胎與子宮內膜分子層面對話的深入研究將有助于提高反復失敗IVF-ET患者妊娠成功率，然而目前對胚胎誘導子宮內膜容受性提升的具體機制研究甚少，尚無關于各胚胎組分對子宮內膜容受性的影響，胚胎共培養可引起子宮內膜容受性的增加，而與子宮內膜直接接觸的是透明帶，透明帶是否在誘導子宮內膜容受性方面起作用？ Fujiwara等[11]就曾提出“透明帶是否給母體內在信號，使其識別發育中的胚胎”的問題，并提出疑問：具體是胚胎的哪一部分參與了子宮內膜容受性的主要誘導過程？

圖3免疫組織化學染色

圖4實時定量RT-PCR檢測胚胎各部分對子宮內膜容受性因子LIF、整合素β3mRNA水平的誘導作用

這項研究是醫學領域第一次探索早期胚胎誘導子宮內膜容受性的空間結構，并通過小鼠的體內和體外實驗兩個途徑共同驗證。收集2細胞期胚胎后分別體內移植透明帶、卵裂球、完整胚胎以及培養液后，孕第4 d檢測容受性因子的表達，發現有手術操作孕第4 d的表達并不高于孕第2 d，孕第4 d各組之間的表達也沒有差異，但正常見陰道栓后無手術操作組的表達顯著高于各組，可能原因有：(1)個體之間差異過大；(2)采用水合氯醛麻醉和開腹手術移植對小鼠的子宮和整個機體的影響較大，僅僅經過2 d子宮內膜容受性因子的表達也可能會受到影響，影響子宮內膜容受性或種植窗正常時期、正常量的表達及開啟；(3)體內移植雙側宮角各3枚，移植胚胎數量較少，不足以引起明顯的分子對話使小鼠子宮內膜容受性因子表達增加。

胚胎與子宮內膜體外共培養使得分子對話機制更加利于研究，體外實驗避免了明顯的個體差異，研究證實早期胚胎與子宮內膜上皮共培養可提高IVF-ET成功率[3-5]，Horcajadas等[12]發現,行IVF-ET患者的胚胎與自身子宮內膜上皮細胞共培養可改變子宮內膜上皮細胞100余基因的改變，說明胚胎可誘導影響子宮內膜發生相應變化以及引起子宮內膜容受性的增加。除了基礎實驗，在人類IVF-ET中，有學者報道通過2次移植提高反復失敗患者的臨床妊娠率的研究也表明胚胎與內膜之間存在相互誘導作用[13-15]。本實驗中培養后空白對照與見栓后2 d的表達無明顯差異，共培養2 d后，胚胎共培養組子宮內膜LIF和整合素β3表達高于透明帶共培養組、卵裂球共培養組及空白組，此結果的可能原因有：(1) 體外共培養中子宮內膜組織在培養2 d后仍具有子宮內膜容受性，但HE切片顯示結構已變得松散，部分組織細胞可能已經壞死、凋亡，正常功能的行使可能也受影響，同時說明即使有組織細胞的凋亡，但共培養對子宮內膜的誘導作用彌補了凋亡壞死所致缺少量；(2) 胚胎操作可能對胚胎、卵裂球、透明帶的損傷使其功能受損，如Kurokawa等[16]發現,ICSI后胚胎因子改變與IVF不同，曾提出ICSI安全性的問題；(3) 所用小鼠為正常小鼠，小鼠的繁殖能力較強，且并無著床障礙等病理狀態，體內移植的各組和體外共培養各組對子宮內膜的誘導作用不夠明顯；(4)完整胚胎可以誘導子宮內膜容受性，透明帶與卵裂球不能單獨完成分子對話功能，既往研究也證明了胚胎與子宮內膜共培養可促進早期胚胎的優質胚胎率和囊胚形成率[17]，同時王麗等[18]的研究在細胞實驗上證實胚胎與子宮內膜上皮細胞共培養可提高子宮內膜上皮細胞容受性分子的表達。

圖5Westernblotting檢測胚胎各部分對子宮內膜容受性因子LIF和整合素β3蛋白水平的誘導作用

綜上，這項小鼠動物實驗證實，對于正常生殖功能小鼠，胚胎完成與子宮內膜的分子對話需要完整的空間結構，然而單純卵裂球和透明帶不能明顯地體現分子對話的功能，對于著床障礙、免疫性不孕等病理狀態以及人類和其它物種在胚胎與子宮內膜相互作用的生理基礎仍需繼續探討研究。

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Mouseearlyintegralembryoinducesexpressionofendometrialintegrinβ3andleukaemia-inhibitoryfactor,andimprovesuterinereceptivityinmice

LI Ting-ting, FANG Cong, JIA Lei, YUE Chao-min

(CenterforReproductiveMedicine,TheSixthAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510655,China.E-mail:qingqingwenyuan@126.com)

AIM: To investigate the changes of endometrial receptivity under the effect of mouse embryo bothinvitroandinvivo, and to figure out which part of the embryo induces the change.METHODSScanning electron microscope was applied to observe the pinpode formation on day 4 endometrium bothinvitroandinvivo. The expression of integrin β3and leukaemia-inhibitory factor(LIF) on day 2 pregnant mouse endometrium , day 4 endometrium after co-culture for 2 d with day 2 embryo , blastomere and zona pellucida as well as control groupinvitrowere detected by the methods of fluorescent quantitative PCR, immunohistochemistry and Western blotting. The same tests were conducted in theinvivopart of the experiment with the integral embryo or different parts of the embryo being transferred to pseudopregnant mouse uterus. On day 4 of the pregnancy, the endometrium was extracted to carry out the tests.RESULTSAfter co-cultured for 2 d with whole embryo, the experssion of integrin β3and LIF was higher than that in any other group in theinvitropart. The expression of integrin β3and LIF on day 4 of normal pregnancy was higher than that in any other group in theinvivoexperiments.CONCLUSIONMouse embryo as a whole is able to induce better endometrial receptivity, while any separated part of embryo, such as blastomere or zona pellucida, couldn’t.

Embryo; Integrin β3; Leukaemia-inhibitory factor; Endometrial receptivity

R321.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.02.001